Хроматографический метод выделения и очистки рекомбинантных белков

Процесс их производства обычно включает экспрессию в генетически модифицированных клетках-хозяевах (таких как кишечная палочка, клетки яичника китайского хомячка, дрожжи, клетки насекомых) с последующим выделением и очисткой целевых белков из сложных клеточных культур или лизатов. Технология хроматографии стала краеугольным камнем в производстве рекомбинантных белков благодаря высокому разрешению, селективности и хорошей масштабируемости. Для разработки надёжного, эффективного, экономичного процесса хроматографической очистки, соответствующего нормативным требованиям, необходим создать четкую систематическую стратегию.

Основные цели разработки технологического процесса

• Высокая степень очистки: эффективное удаление белков клеток-хозяев (БХК), нуклеиновых кислот (ДНК/РНК), эндотоксинов, вирусов (при необходимости), компонентов среды, примесей, связанных с продуктом (агрегатов, деградировавших фрагментов, неправильно свернутых форм, посттрансляционно модифицированных вариантов и т. д.).
• Высокая степень извлечения: максимальное увеличение выхода целевого белка и снижение производственных затрат.
• Устойчивость: процесс устойчив к небольшим изменениям в сырье (например, буферах, смолах), колебаниям рабочих параметров.
• Масштабируемость: процессы, разработанные в лабораторных условиях, можно успешно масштабировать до пилотных и производственных масштабов.
• Экономичность: оптимизация этапов процесса, сокращение количества этапов хроматографии, увеличение загрузки смолы и срока ее службы, а также снижение расхода буфера.
• Соответствие требованиям: соответствует требованиям надлежащей производственной практики (GMP), имеет хорошую основу для характеризации процесса (PC) и валидации процесса (PV), а также обеспечивает качество и безопасность продукции (особенно способность уничтожать вирусы).
• Скорость: сокращение времени цикла очистки и повышение эффективности производства.

Подход к разработке хроматографических процессов

Этап 1: предварительное исследование и определение цели

Глубокое понимание целевых белков:  

•  физико-химические свойства: молекулярная масса, изоэлектрическая точка (pI), гидрофобность, стабильность (pH, температура, окислительно-восстановительные реакции, сила сдвига), посттрансляционные модификации (гликозилирование, фосфорилирование и т. д.). 
•  Биологическая активность: методы функционального обнаружения. 
• Критически важные характеристики качества (КВХК): характеристики, которые напрямую влияют на безопасность и эффективность продукта (чистота, активность, содержание агрегатов, неоднородность заряда, распределение гликоформ, остатки примесей клетки-хозяина, эндотоксины, вирусные частицы и т. д.).
•  Характеристики системы экспрессии: тип клетки-хозяина (определяет основной профиль примесей), форма экспрессии (внутриклеточная, секреторная, тельца включения), состав, вязкость, содержание твёрдых частиц в растворе для сбора/лизате.

Уточнение цели процесса:

 Установите целевые показатели чистоты и выхода, предельные затраты, сроки, целевые показатели масштабирования, нормативные требования (например, требования к уничтожению вирусов).

 Изучение литературв и справочных материалов по платформе:

 Изучите стратегию очистки аналогичных белков и используйте существующие платформенные технологии (например, платформу Protein A для моноклональных антител).

Этап 2: выделения белка

Цель: быстро сконцентрировать целевой белок, удалить большую часть объёма и основных примесей (например, клеточный дебрис, нуклеиновые кислоты, липиды, большую часть низкомолекулярных соединений) и стабилизировать целевой белок.

Предпочтительная технология: аффинная хроматография — золотой стандарт для этапа выделения (если доступна и экономически обоснована)

• Моноклональное антитело/слитый белок FC: аффинная хроматография на белке A/G/L. Основное направление разработки: оптимизация условий связывания/элюирования (pH, ионная сила, добавки), оптимизация загрузки, протокол промывки/регенерации, контроль агрегации, удаление лиганда Protein A.
• Белки слияния с метками: His-Tag (IMAC), GST-Tag, FLAG-Tag и т. д. Основное направление разработки: специфичность связывания, условия элюирования (концентрация имидазола, восстановитель, pH), стратегия удаления меток (например, ферментативное расщепление), потенциальные примеси, связанные с метками.

Альтернативные методы (когда аффинная хроматография неприменима):

•   Ионообменная хроматография (ИОХ): для улавливания отрицательно заряженных примесей (нуклеиновых кислот, кислых гидрокортикостероидов) часто используется сильный анионообменник (например, MaXtar® Q, Q Chromstar® FF), который пропускает целевой белок. Или подбирается в соответствии с изоэлектрической точкой pI. 
• Хроматография на основе гидрофобных взаимодействий (ГФИ): связывание целевых белков или примесей при высокой концентрации солей. Чувствительна к концентрации солей. 
• Осаждение/флокуляция: Иногда используется для предварительного концентрирования и удаления примесей (например, осаждение нуклеиновых кислот) в качестве предварительной обработки перед хроматографией.

Пример 1. В проекте по рекомбинантной субъединице herpes zoster используется режим элюирования MaXtar® Q-binding, при котором 20%  элюируется с примесью, а 35% - с целевым белком.

• Хроматографическая колонка и сорбент: 2,6 см в диаметре и 20 см в высоту
• Образец: Культуральный супернатант. Целевая концентрация белка составляла 0,7 мг/мл
• Объем загрузки: 804 мл
• Раствор A: 20 мМ PB, pH 6,8
• Раствор B: 20 мМ PB, 1 М NaCl, pH 6,8
• Скорость потока: 120 см/ч
• Градиент: 20 % элюирования, 35 % элюирования

Ключевые моменты фазы выделения:

• Высокая связывающая способность и высокая скорость потока: выбирайте сорбенты с крупными частицами, которые хорошо переносят высокие скорости потока.
• Предварительная фильтрация/осветление: оптимизируйте глубинную фильтрацию, центрифугирование или тангенциальную фильтрацию (TFF) для удаления твердых частиц и защиты колонки.
• Подготовка образца: оптимизируйте pH, электропроводность, добавьте вещества (например, ингибиторы протеаз, восстановители), чтобы улучшить связывание и стабильность.
• Проточный режим в сравнении с режимом связывания и элюирования: выбор в зависимости от профиля примесей и свойств целевого белка.

Этап 3: Промежуточная очистка

Цель: удалить критические примеси (например, HCP, агрегаты, несовпадающие изомеры, потерявшие сродство лиганды, ДНК хозяина) со свойствами, схожими со свойствами целевого белка.

Основные технологии: ионообменная хроматография (IEX) и хроматография на основе гидрофобных взаимодействий (HIC) — наиболее часто используемые этапы промежуточной очистки, в которых для разделения используются различия в заряде или гидрофобности. Обычно эти этапы не связаны с этапом выделения (разный принцип разделения).
IEX: точная оптимизация pH (приближение к изоэлектрической точке целевого белка для максимизации разницы в заряде), условий градиентного или ступенчатого элюирования, вида буфера и ионной силы. Катионообменный (например, MaXtar® S, SP Chromstar® ) и анионообменный (например, MaXtar® Q, Q Chromstar® ) сорбенты выбираются в зависимости от изоэлектрической точки и профиля примесей целевого белка.
HIC: оптимизация вида соли (обычно сульфата аммония), начальной концентрации соли, условий градиентного или ступенчатого элюирования, добавок. Перемешивайте при высоком содержании соли и элюируйте с пониженной концентрацией соли. Это хорошо удаляет отложения.

Другие методы:

•  Многомодовая хроматография (MMC): при сочетании нескольких факторов (например, ионный обмен + гидрофобные/водородные связи) селективность может быть выше, но механизм более сложный и его немного сложнее разработать (например, MaXtar® MMC).
• Хроматография на гидроксиапатите (HAP): оказывает уникальное воздействие на некоторые трудноразделимые примеси (например, отделившийся белок А, ДНК, агрегаты).

Пример 2. Phenyl Chromstar использовался на втором этапе проекта по созданию рекомбинантной субъединицы опоясывающего лишая. Режим элюирования связывания Phenyl Chromstar® HP: 30 % элюирования примесей и 70 % элюирования целевого белка.

•  Хроматографическая колонка и сорбент: диаметр 2,6 см, высота 13,8 см
•  Образец: элюирующий коллектор MaXtar® Q (сульфат аммония добавлен для достижения проводимости 98–105 мс/см), концентрация образца 1,86 мг/мл
• Объем загрузки: 218 мл
• Раствор A: 0,6 М (NH4)2SO4 · PBS
• Раствор B: вода
• Скорость потока: 120 см/ч
• Градиент: 30 % элюирования, 70 % элюирования

Этап 4: финальная очистка

Цель: удаление следовых примесей (особенно тех, которые очень близки по свойствам к целевому белку, таких как следовые примеси HCP, вариации, связанные с продуктом, димеры/олигомеры), чтобы в конечном итоге достичь желаемых стандартов высокой чистоты. Кроме того, это часто критически важный этап очистки от вирусов (для продуктов, полученных методом экспрессии в клетках млекопитающих).

Основная технология: 

• Ионообменная хроматография (ИОХ): окончательная очистка в более мягких условиях (с более пологим градиентом, с использованием смол с более высоким разрешением), разделение зарядовых изомеров.
• Эксклюзионная хроматография (ЭХ): основана на дифференциальном разделении по молекулярной массе и является золотым стандартом для удаления агрегатов (особенно высокомолекулярных агрегатов) и разрушенных фрагментов с одновременной заменой буфера. Недостатками являются низкая скорость обработки, низкая связывающая способность и разбавление образцов. Часто используется на заключительных этапах или при анализе.
• Проточная анионообменная хроматография: на этапе очистки целевой белок пропускают через колонку при высоком pH (> pI), и примеси связываются с колонкой благодаря отрицательно заряженной природе большинства гликопротеинов и вирусных частиц.

Пример 3. На третьем этапе проекта по очистке рекомбинантной субъединицы вируса опоясывающего герпеса используется хроматография с использованием SP Chromstar® в проточном режиме F, где дополнительно удаляются примеси.

• Хроматографическая колонка и сорбент: 2,6 см в диаметре и 10 см в высоту
• Образец: раствор после ультрафильтрации, концентрация 0,9 мг/мл
• Объем загрузки: 178 мл
• Раствор A: 20 мМ PB, pH 5,8
• Раствор B: 20 мМ PB, 1 М NaCl
• Скорость потока: 60 см/ч
• Градиент: проточный режим

Ключевые факторы успеха и сложности

Глубокое понимание целевого белка и профиля примесей: основа для выбора правильного метода разделения. Используйте аналитические методы (ВЭЖХ, капиллярную электрофорез, электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, вестерн-блоттинг, масс-спектрометрию, гель-хроматографию с обращённо-фазовым разделением и т. д.) для контроля всего процесса.  
Принцип ортогональности: сочетание хроматографических методов, основанных на разных принципах разделения, — ключ к достижению высокой степени чистоты. 
Платформенная стратегия: для схожих категорий продуктов (например, моноклональных антител) внедрение стандартизированных платформенных процессов может значительно ускорить разработку.
Quality by Design, QbD: внедряйте философию QbD на ранних этапах разработки, уделяйте особое внимание критериям качества, проводите оценку рисков (например, с помощью анализа видов и последствий отказов), используйте оптимизацию методом дисперсионного анализа и определяйте пространство дизайна.
Вирусная безопасность: процесс производства продуктов из клеток млекопитающих должен включать как минимум два эффективных этапа удаления/инактивации вирусов с использованием различных механизмов (как правило, инкубация при низком pH + проточная обработка AEX + нанофильтрация).
Контроль затрат: основными расходами являются хроматографические сорбенты и расходные материалы. Крайне важно оптимизировать производительность, скорость потока, расход буфера и срок службы сорбента. Рассмотрите возможность использования новых методов, таких как непрерывная хроматография.
Анализ данных и моделирование: ускорьте разработку и оптимизацию с помощью передовых инструментов анализа данных и механизмов/статистических моделей.
 

Заключение

Разработка процесса хроматографии рекомбинантных белков — это сложная, итеративная и целенаправленная системная инженерия. Успешные стратегии начинаются с глубокого понимания целевых белков и примесей и включают в себя тщательный отбор и оптимизацию этапов выделения, промежуточной очистки и доочистки. Всегда помните об основных целях: чистота, выход, надёжность, масштабируемость, экономичность, соответствие требованиям и вирусная безопасность. Применение концепций QbD, инструментов DoE, платформенных стратегий и передовых технологий (таких как непрерывная хроматография) в сочетании с углубленным анализом процессов позволяет разрабатывать высококачественные, эффективные и экологичные процессы хроматографической очистки, отвечающие потребностям коммерческого производства.