Однако из-за ограниченной связывающей способности протеина А и высокой стоимости сорбентов, вопрос увеличения срока их службы приобретает особую значимость. Считается, что срок службы сорбентов при многократном использовании ограничивается двумя основными факторами: гидролизом лиганда и загрязнением сорбента.
Гидролиз лиганда
Гидролиз протеина А происходит при длительном воздействии растворов для очистки (например, гидроксида натрия), в результате чего разрушается лиганд. Загрязнение сорбента возникает при накоплении примесей на его поверхности из-за недостаточной эффективности моющих растворов. Для оценки скорости гидролиза лигандов использовали новые сорбенты, которые подвергали циклическому воздействию растворов щелочи различной концентрации в течение более 250 часов. Падение динамической связывающей емкости (DBC) использовалось как индикатор скорости разрушения лиганда. Как видно на Рисунке 1, более высокие концентрации NaOH приводили к более быстрому гидролизу. При этом понижение температуры снижало скорость разрушения лиганда.
Рисунок 1: Влияние концентрации и температуры NaOH на DBC
Данные показали, что при низких температурах скорость гидролиза можно замедлить. Однако динамическая емкость разных молекул по-разному реагирует на охлаждение. Были протестированы семь модельных белков, включая молекулу B (слитый белок Fc, pI 7,9) и шесть моноклональных антител IgG1 с pI от 6.5 до 8.9. На Рисунке 2 видно, что снижение емкости при низких температурах различается для разных молекул, что частично нивелирует выгоды от охлаждения. Кроме того, работа с колонками в холоде может вызывать дегазацию, что негативно влияет на производственный процесс. Поэтому промывка щелочью при низкой температуре — неидеальное решение.
Рисунок 2: Использование добавок для замедления гидролиза лиганда
Разные добавки по-разному влияют на устойчивость лиганда к гидролизу. В качестве примера рассматривалась молекула E: к раствору NaOH добавляли сахарозу, этиленгликоль и пропиленгликоль. Рисунок 3 показывает, что добавки действительно замедляют разрушение лиганда: устойчивость увеличивалась в 2–3 раза по сравнению с исходными условиями (0.1 M NaOH).
Рисунок 3: Сравнение загрязнения сорбента после щелочной и нещелочной очистки
Для изучения загрязнения сорбента (смолы) после очистки были выбраны три молекулы (одно моноклональное антитело и два слитых Fc-белка). Чтобы максимально загрязнить хроматографическую колонку, осветлённые растворы трёх выбранных молекул подвергли 10 циклам хроматографии на колонке с протеином А, при этом в каждом цикле достигалась только стадия элюирования без очистки колонки. Затем хроматографическую колонку разобрали, а смолы по отдельности инкубировали в разных чистящих растворах при разных температурах в течение 2 часов. Затем смолы были трижды промыты уравновешивающим буфером, и в качестве контроля были использованы исходные смолы. На данный момент остатки на смолах представляли собой неочищенные загрязнения. Готовую суспензию сорбента разбавляли до 1-кратного объема загрузочного буфера SDS PAGE, инкубировали при 80°C в течение 10 минут, а надосадочную жидкость собирали для анализа SDS PAGE. Чем больше белков присутствовало в геле SDS PAGE, тем больше было неочищенных загрязнений.
Как видно на рисунке 4, использование более высоких концентраций гидроксида натрия (0,1 М и 0,3 М, дорожки 2, 4, 5) в качестве чистящих растворов значительно превосходит по эффективности 0,02 М (дорожка 3). Эта тенденция сохраняется для всех трёх тестируемых молекул. Хотя 0,3 М NaOH лучше справляется с молекулой A, чем 0,1 М NaOH, результаты для двух других молекул сопоставимы. Кроме того, нещелочной очищающий раствор с pH 11 (дорожка 6) хорошо очищает молекулу A, но менее эффективен для других молекул. Это подтверждает теорию о том, что нещелочные очищающие растворы не подходят для очистки всей платформы. Интересно, что температура, по-видимому, не влияет на эффективность очистки сорбента. Аналогичные результаты были получены как при комнатной, так и при более низкой температуре (дорожки 4 и 5) при использовании более высокой концентрации гидроксида натрия (0,3 М).
Рисунок 4
Чтобы лучше понять, как продолжительность очистки влияет на её эффективность, были проведены дополнительные эксперименты с использованием молекулы B (слитый белок Fc, pI 7,9) в качестве репрезентативного образца. Смолы, загрязнённые молекулой B, подвергались инкубации в чистящих растворах в течение разного времени. Как показано на рис. 5, с увеличением времени инкубации на дорожках геля появляется меньше белков, что свидетельствует о более эффективной очистке. Однако увеличение времени инкубации может привести к большей деградации лиганда, поэтому для достижения оптимального срока службы сорбента необходимо учитывать как время инкубации, так и степень деградации лиганда.
Рисунок 5. Исследование срока службы сорбента
На основании приведённых выше данных в качестве чистящих растворов были выбраны 0,1 М NaOH и 0,1 М NaOH + 20 % этиленгликоля (EtGly) для оценки возможности их повторного использования. Как показано на рисунке 6, при добавлении 20 % этиленгликоля срок службы колонки увеличился почти вдвое без какого-либо снижения качества продукта. Использование этиленгликоля в качестве добавки для очистки колонок для аффинной хроматографии приводит к постепенному увеличению объёма элюирования по мере увеличения количества циклов, но это увеличение не влияет на качество соответствующего продукта. Таким образом, этиленгликоль по-прежнему можно использовать в качестве очищающей добавки для аффинной хроматографии.
В сорбенте для аффинной хроматографии BioLink MaXtar® ARPA Protein A используется лиганд, обладающий высокой устойчивостью к щелочам. В нем используются инновационные процессы формирования гранул, методы связывания и лиганды, что обеспечивает исключительную устойчивость к щелочам. При безразборной обработке 0,5 М NaOH в течение 15 минут в каждом цикле динамическая связующая способность (DBC) MaXtar® ARPA сохраняет более 90% от своей первоначальной емкости после 200 циклов.
Ссылки:
Чжан Дж., Шива С., Кэппел Р., Гоуз С., Гронке Р. Увеличение срока службы смол на основе белка А. Biotechnol Prog. 2017 May;33(3):708-715. doi: 10.1002/btpr.2448. Опубликовано 20 марта 2017 г. PMID: 28218470.
