Присутствие микоплазм — одна из самых распространенных и серьезных проблем, нарушающих целостность клеточной культуры. Поскольку эти микроорганизмы не приводят к помутнению среды, для их точной идентификации требуются специальные методы.
В ExCell Bio и Biomirix мы придерживаемся комплексного подхода к решению этой проблемы. Правильный метод выявления микоплазм обеспечивает достоверность исследований и непрерывность производства. В этой статье мы расскажем об основных методах эффективного выявления микоплазм в лабораторных условиях.
Надежное выявление микоплазм зависит от выбора подходящего, проверенного метода, соответствующего этапу работы и нормативным требованиям. Надежная программа обеспечения качества часто включает в себя несколько методов, например ПЦР для частого и быстрого скрининга и культуральные методы для окончательной проверки. Внедрение планового протокола тестирования на микоплазму является важнейшей мерой защиты, обеспечивающей уверенность в том, что клеточные культуры не содержат этот скрытый источник экспериментальной вариативности и риска для продукта.
Как выявить заражение клеточной культуры микоплазмами
Молекулярные методы: анализ на основе ПЦР
Методы амплификации нуклеиновых кислот, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР), сегодня являются стандартом для выявления микоплазм. Этот метод нацелен на специфические, консервативные последовательности ДНК, уникальные для микоплазм. Основным преимуществом теста на микоплазмы на основе ПЦР является высокая чувствительность и скорость получения результатов — зачастую они готовы уже через несколько часов. Он может выявлять очень низкие уровни загрязнения и эффективен для широкого спектра видов микоплазм. Однако он требует тщательной разработки, чтобы избежать перекрестной реактивности с клеточной ДНК, и не позволяет проводить различие между жизнеспособными и нежизнеспособными организмами, что учитывается при интерпретации данных.Традиционный микробиологический посев
Культуральный метод, хотя и более медленный, остается высокочувствительным способом определения микоплазмы. Этот метод предполагает внесение образца в специализированные бульонные и агаровые среды, способствующие росту микоплазм. Положительный результат подтверждается характерной морфологией колоний в виде «яичницы-глазуньи» на твердом агаре после инкубации в течение 28 дней. Преимущество этого метода заключается в его способности выявлять широкий спектр видов и подтверждать наличие жизнеспособных, делящихся организмов. Многие фармакопейные руководства по-прежнему требуют или рекомендуют использовать этот метод для тестирования готовой продукции из-за его доказанной надежности.Прямое окрашивание и использование косвенных индикаторов
К альтернативным методам относится прямое окрашивание ДНК флуоресцентными красителями, такими как Hoechst 33258, который связывается со всей ДНК. При наблюдении под флуоресцентным микроскопом микоплазмы выглядят как внеядерные вкрапления на поверхности инфицированных клеток. Этот метод удобен для быстрого скрининга, но требует опыта для точной интерпретации результатов и менее чувствителен, чем ПЦР или культуральное исследование. Косвенные методы, такие как мониторинг изменений в клеточном метаболизме или скорости роста, могут указывать на потенциальную проблему, но не являются специфичными. При наличии этих признаков необходимо провести официальное исследование на наличие микоплазм с использованием одного из основных методов, перечисленных выше.Надежное выявление микоплазм зависит от выбора подходящего, проверенного метода, соответствующего этапу работы и нормативным требованиям. Надежная программа обеспечения качества часто включает в себя несколько методов, например ПЦР для частого и быстрого скрининга и культуральные методы для окончательной проверки. Внедрение планового протокола тестирования на микоплазму является важнейшей мерой защиты, обеспечивающей уверенность в том, что клеточные культуры не содержат этот скрытый источник экспериментальной вариативности и риска для продукта.
