Питательные среды - определение
Питательные среды для культивирования клеток (также известные как культуральные среды для выращивания клеток) — это обогащённые питательными веществами жидкие или гелеобразные составы, предназначенные для поддержания роста и размножения клеток в искусственных условиях (in vitro). Они обеспечивают клетки необходимыми питательными веществами, а также поддерживают ключевые параметры среды — такие как осмоляльность и уровень pH.По сравнению с микробиологическими питательными средами, биотехнологические среды для культивирования клеток обычно имеют более сложный состав, поскольку клетки, полученные из целостных организмов, часто требуют дополнительных компонентов — например, гормонов или факторов роста, — которые в норме присутствуют in vivo.
Такие среды подбираются в зависимости от типа клеток (включая культуры млекопитающих, растений, насекомых, бактерий, дрожжей и вирусов). Выбор питательной среды существенно влияет на результаты процесса культивирования, поэтому его следует тщательно продумывать для успешного проведения исследований клеток в условиях in vitro или разработки мелкомасштабного процесса.
Компоненты питательных сред: основные и дополнительные
Питательные среды для культивирования клеток состоят из комбинации соединений и питательных веществ, предназначенных для поддержания роста клеток. К распространённым компонентам питательных сред для культивирования клеток относятся:
1. Аминокислоты. Служат «строительными блоками» белков. Включают незаменимые и заменимые аминокислоты, поддерживающие синтез белков и стимулирующие рост клеток.
2. Углеводы (источники углерода). Обеспечивают клетки энергией. Чаще используют глюкозу, но возможны альтернативы: галактоза, фруктоза, мальтоза и др. Выбор зависит от метаболизма клеток.
3. Источники азота. Необходимы для синтеза аминокислот и нуклеиновых кислот. Представлены солями аммония, нитратами, мочевиной.
4. Неорганические соли. Регулируют мембранный потенциал и осмоляльность. Содержат калий, натрий, магний, кальций, фосфор, серу.
5. Макро‑ и микроэлементы. Критичны для роста и функционирования клеток. Макроэлементы (железо, магний, кальций) и микроэлементы (цинк, медь, селен и др.) выступают кофакторами ферментов. Особенно важны в бессывороточных средах.
6. Витамины. Участвуют в метаболических процессах. Добавляются в бессывороточные среды или поступают из сыворотки. Ключевые: биотин, пантотеновая кислота, тиамин.
7. Сыворотка. Комплексный компонент с факторами роста, гормонами, аминокислотами, липидами и др. Чаще используют бычью сыворотку (FBS).
8. Факторы роста. Стимулируют пролиферацию и выживаемость клеток. Примеры: дрожжевой экстракт, триптон, казаминовые кислоты.
9. Гормоны. Модулируют клеточные функции. В растительных средах — ауксины, цитокинины, гиббереллины; в животных — регулируют метаболизм.
10. Буферные системы и индикаторы pH. Поддерживают pH 7,2–7,4 (для большинства животных клеток). Основной буфер — бикарбонат натрия. Для визуального контроля применяют феноловый красный: он меняет цвет в диапазоне pH 6,2–8,2 (от жёлтого к красному), позволяя отслеживать отклонения кислотности.
11. Липиды и жирные кислоты. Важны для мембран и энергетического обмена. В бессывороточных средах добавляются отдельно.
12. Белки и пептиды. Заменяют компоненты сыворотки в бессывороточных средах. Ключевые: альбумин, трансферрин, фибронектин.
13. Антибиотики. Предотвращают загрязнения. Часто используют PenStrep (пенициллин + стрептомицин). В бессывороточных средах повышают риск токсичности.
14. Дополнительные органические добавки. Применяются ограниченно из‑за низкой воспроизводимости.
15. Загустители/гелеобразователи. Для твёрдых сред используют агар‑агар (0,7–0,8 %). Образует гель при pH 5,6–6,0, плавится при 100 °C, затвердевает при 45 °C.
Классификация питательных сред
Существует несколько типов классификации питательных сред исходя из их происхождения, состава, формы и метода изготовления. Давайте детально разберемся с каждым из них.
- Классификация по разнообразию компонентов
Питательные среды могут быть базальные (базовые) и комплексные. Базовая питательная среда обычно состоит из минимального набора питательных веществ, необходимых для роста, таких как источник углерода, аминокислоты и соли. Базовая питательная среда часто используется для селективного культивирования определённых клеток, поскольку позволяет добавлять в неё определённые питательные вещества или другие факторы, необходимые для роста.В отличие от базовой питательной среды, комплексная питательная среда содержит более широкий спектр питательных веществ, включая дополнительные аминокислоты или витамины. Комплексная питательная среда часто используется, когда потребности клеток в питательных веществах неизвестны или когда целью является получение большого количества клеток. Сложные среды могут также содержать дополнительные компоненты, такие как кровь, сыворотка или экстракты тканей, которые могут обеспечивать дополнительные факторы роста и поддерживать рост более требовательных клеток.
- Классификация по химическому составу
Исходя из химического состава выделяют два типа сред: натуральные и искусственные (синтетические).Натуральные среды — это среды, полученные в результате экстракции тканей или биологических жидкостей животных, таких как плазма, лимфа и сыворотка. Натуральные среды также можно разделить на три группы:
Биологические жидкости: например, сыворотка, плазма, лимфа и околоплодные воды.
Экстракты тканей: например, эмбриональные, костномозговые, опухолевые и печёночные экстракты.
Сгустки или коагулянты: например, сгустки плазмы и коагулянты.
Сыворотка — наиболее распространённая натуральная среда. Сыворотка используется даже в качестве добавки в культурах на синтетических средах. Бычья сыворотка популярна благодаря многочисленным преимуществам, в том числе чистоте и длительному сроку хранения.
Синтетические среды. Синтетические среды (также известные как искусственные среды) создаются с использованием различных органических и неорганических соединений. К синтетическим средам относятся:
Среды, содержащие сыворотку: синтетические среды, в которые добавляется сыворотка.
Среды без сыворотки: среды без сыворотки (SFM) более стабильны, чем среды, содержащие сыворотку, что позволяет исследователям поддерживать рост и пролиферацию клеток без использования сыворотки.
Химически определённые среды: химически определённые среды не содержат примесей и состоят только из очищенных органических и неорганических компонентов.
Среды без белка: среды без белка не содержат белка. Белковые добавки добавляются по мере необходимости.
Сбалансированные солевые растворы (BSS): сами по себе используются для поддержания жизнеспособности клеток. BSS обогащаются питательными веществами и другими соединениями для создания культуральных сред, способных поддерживать рост и размножение клеток. Таким образом, BSS составляют основу многих типов сложных сред.
Бессывороточные среды (SFM) часто делят на базовые и комплексные. Базовые среды не содержат добавок. Если в базовую среду добавить добавки для роста, она станет комплексной.
К распространенным средам относятся MEM (Minimum Essential Medium), DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium), RPMI-1640, Ham’s F-10, Ham’s F-12.
Чем оперировать при выборе питательной среды?
Самый важный шаг — определить, какой тип питательной среды для культивирования клеток использовать. При таком разнообразии коммерческих сред выбор может оказаться непростым. Начните с изучения клеточной линии, которую вы будете использовать, чтобы определить, какие питательные среды для культивирования рекомендуются. Затем вы можете выбрать несколько сред и попробовать их, чтобы понять, какая из них подходит лучше всего. Вот несколько факторов, которые следует учитывать.- Выбрать подходящую форму
1. Порошковая среда: порошковые среды самые дешёвые, но их нужно должным образом подготавливать перед работой, что усложняет процесс.
2. Концентрированная среда: концентрированная среда требует только разбавления.
3. Рабочий раствор: рабочие растворы — самый простой тип сред. Они предназначены для использования без каких-либо манипуляций со стороны специалистов.
Выбрать тип: натуральная или синтетическая
Сывороточные среды получают удалением гемалейцина из плазмы. Они содержат питательные вещества (аминокислоты, витамины, минералы, жирные кислоты), компоненты для адгезии клеток, факторы роста и гормоны. Однако их состав неоднороден, что ограничивает применение в масштабных экспериментах. Кроме того, они могут содержать вредные для клеток соединения, быть подвержены загрязнению, усложнять выделение продуктов культур и стоить дорого. Синтетические среды однородны и дешевле, что удобно при масштабировании исследований. Но они более чувствительны к экстремальным значениям температуры, pH и осмоляльности.
- Выбрать конкретную среду
Ключевые критерии выбора:
1.типы клеток и их потребности;
2. возможности и ограничения лаборатории;
3. цель эксперимента.
Например, для плюрипотентных стволовых клеток нужны среды, поддерживающие их свойства (например, RPMI‑1640). При затруднениях стоит обратиться к производителям сред — они помогут определиться, если чётко обозначить тип клеток, цели и требования лаборатории.
Оптимизация питательной среды
Несмотря на то, что на рынке доступно множество вариантов питательных сред для культивирования клеток, разработка и оптимизация питательных сред попрежнему являются важными задачами для тех, кто занимается биотехнлогической разработкой. Правильно оптимизированные питательные среды для культивирования клеток могут поддерживать высокую плотность клеток при минимальных изменениях клеточного фенотипа, что приводит к высокой биологической активности.Даже учитывая это, полной оптимизации часто не проводят из-за большой рабочей нагрузки, связанной с этой задачей. Оптимизация биотехнологических сред включает в себя несколько ключевых этапов, направленных на повышение роста и продуктивности микроорганизмов или клеток, используемых в биотехнологиях:
Отбор базовых сред. Первым этапом оптимизации биотехнологических сред является отбор различных базовых сред для определения тех, которые способствуют росту и продуктивности клеток или микроорганизмов. Это можно сделать с помощью простых эмпирических методов или более сложных статистических методов, таких как планирование экспериментов (DOE).
Определение критически важных компонентов. После выбора подходящей базовой среды важно определить, какие компоненты являются критически важными для роста и продуктивности. Этого можно добиться, систематически изменяя концентрацию отдельных компонентов и наблюдая за их влиянием на рост и продуктивность клеток.
Оптимизация критически важных компонентов. На основе результатов, полученных на этапе 2, можно оптимизировать концентрацию критически важных компонентов для достижения максимального роста и продуктивности. Это можно сделать с помощью комбинации эмпирических методов и математических моделей, таких как метод поверхности отклика.
Проверка оптимальных условий. После определения оптимальных условий важно проверить их, повторив эксперименты и убедившись, что получены те же результаты.
Масштабирование процесса. После оптимизации биотехнологической среды процесс можно масштабировать от лабораторного до промышленного уровня, обеспечив сохранение оптимальных условий для роста и продуктивности.
Постоянный мониторинг и совершенствование. Оптимизация биотехнологической среды — это непрерывный процесс, поскольку изменения в условиях биотехнологического процесса, используемых микроорганизмах или клетках могут потребовать дальнейшей корректировки компонентов среды. Важно постоянно отслеживать эффективность биопроцесса и при необходимости вносить улучшения для обеспечения оптимального роста и продуктивности.
В целом оптимизация среды для биопроцесса является важнейшим аспектом биопроизводства, поскольку она напрямую влияет на стоимость, качество и экологичность конечного продукта. Процесс оптимизации может быть сложным и длительным, но его результаты могут быть значительными с точки зрения улучшения роста и продуктивности, снижения затрат и повышения экологичности.
