Валидация жизненного цикла хроматографических сорбентов

За последние 20 лет биотехнологии в Китае значительно продвинулись вперёд, а биофармацевтические препараты привлекают всё больше внимания. Исходное сырьё для производства биофармацевтических препаратов формирует основу всей отрасли, а его качество, стабильность и доступность напрямую влияют на исследования в области создания новых лекарственных средств. В части исходного сырья важнейшую роль в обеспечении чистоты, эффективности и безопасности биофармацевтических препаратов играют хроматографические сорбенты. Строгий контроль над хроматографическими сорбентами необходим для поддержания стабильных показателей процесса и качества готовой продукции.

В процессе биотехнологической очистки для разделения и фильтрации часто используется метод хроматографии и соответствующие хроматографические сорбенты. Однако со временем в сорбенте накапливаются примеси. Срок службы хроматографических сорбентов обычно определяется количество циклов, которые сорбент может выдержать в определенных условиях процесса, прежде чем его характеристики начнут отклоняться от заданных параметров процесса. Оценка проводится с использованием ключевых показателей, таких как динамическая связывающая способность, содержание белка в клетках-хозяевах (БХК), нуклеиновых кислот, липидов, побочных продуктов метаболизма в процессе культивирования, а также уровень эндотоксинов.

Зачем валидировать жизненный цикл сорбента?

1. Контроль затрат: стоимость одной партии хроматографического сорбента может достигать сотен тысяч и миллионов рублей, поэтому продление его срока службы может значительно сократить расходы. 
2. Стабильность процесса: проверка срока службы гарантирует, что снижение эффективности сорбента будет находиться в контролируемом диапазоне, что обеспечит стабильность процесса и качество продукции. 
3. Соответствие нормативным требованиям: соответствует требованиям GMP и FDA/EMA к проверке критически важных расходных материалов.

Факторы, влияющие на сроку службы сорбента

1. Тип лекарственного вещества
2. Тип хроматографического сорбента
3. Обслуживание хроматографической колонки
4. Состав хроматографической системы
5. Качество набивки хроматографической колонки
6. Качество реагентов

Создание и валидация хроматографической модели малого масштаба

Сначала создаётся уменьшенная модель хроматографического этапа, после чего проводится соответствующая экспериментальная проверка модели. Разработка этой уменьшенной модели основана на принципах масштабирования хроматографии, которые гарантируют, что ключевые параметры, такие как высота колонки, линейная скорость потока, вместимость для загрузки образца, объёмы для очистки и элюирования, а также эффективность колонки, останутся неизменными. Для подтверждения модели требуется провести три повторных эксперимента и сравнить рабочие параметры в лабораторном, пилотном и производственном масштабах. Данные показывают, что существенных различий в параметрах в разных масштабах нет. Эта уменьшенная модель считается надёжным отображением производительности в промышленных масштабах и подходит для изучения характеристик процесса.
 
Уменьшенную модель и проверку срока службы и очистки хроматографического сорбента можно проводить одновременно. Процесс проверки включает оценку таких факторов, как количество примесей, выход продукта и уровень эндотоксинов, чтобы определить, соответствует ли сорбент требуемым стандартам и сохраняет ли он эффективность, как показывает уменьшенная модель. Создание и подтверждение уменьшенной модели имеет решающее значение для управления крупномасштабными хроматографическими процессами.

Очистка и обращение с хроматографическими сорбентами

1. Регенерация:
Регенерация проводится после каждого цикла хроматографии для восстановления исходной функциональности смолы (сорбента). Выбор буфера зависит от типа сорбента. Например, для ионообменного сорбента обычно используется 2 М раствор NaCl, а для сорбента с гидрофобным взаимодействием — очищенная вода или буфер с низкой концентрацией.

2. CIP (очистка на месте):
CIP удаляет примеси, которые не удаляются во время регенерации, и помогает предотвратить накопление загрязнений. Обычно это делается после 1–10 циклов. Для каждого конкретного типа хроматографического сорбента следует выбирать подходящие чистящие растворы в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

3. Дезинфекция:
Дезинфекция проводится между производственными циклами для устранения микробного загрязнения хроматографического сорбента. Обычно для этого используется 0,5–1 М раствор NaOH в течение 30–60 минут. Для сорбентов, несовместимых с NaOH, следует использовать альтернативные методы дезинфекции. Цель состоит в том, чтобы предотвратить рост микроорганизмов и удалить эндотоксины.

4. Хранение:
Правильное хранение направлено на предотвращение роста микроорганизмов и загрязнения хроматографического сорбента эндотоксинами во время операций с перерывами. Условия хранения следует выбирать в зависимости от характеристик сорбента. Обычно используется 20 %-ный этанол или 0,01 М NaOH. Правильное хранение имеет решающее значение для продления срока службы сорбента.

Вещества, удаляемые при очистке сорбента

Очистка хроматографического сорбента направлена на удаление различных типов загрязнений, для каждого из которых требуются свои методы очистки. К распространённым загрязнениям относятся растворимые белки клеток-хозяев, денатурированные белки, гидрофобные белки, липиды, нуклеиновые кислоты, пигменты, эндотоксины и микроорганизмы.

Валидация процесса очистки сорбентов

В процессе проверки эффективности очистки проводится холостой прогон. В ходе этого процесса вместо образца в колонку загружают уравновешивающий буфер, а полученный элюат собирается. Собранные фракции анализируются на наличие остаточных примесей и их концентрацию, чтобы оценить, соответствует ли процедура очистки требуемым стандартам. Холостой прогон помогает подтвердить эффективность очистки и предотвращает риск накопления примесей с течением времени.

Пример 1. Валидация жизненного цикла аффинного хроматографического сорбента MaXtar® Protein A от BioLink

Препарат: осветленная супернатант-культура клеток, содержащая моноклональные антитела, после глубинной фильтрации.
План исследования: было проведено в общей сложности 200 циклов очистки с использованием аффинного сорбента MaXtar® Protein A в соответствии со стандартной процедурой очистки моноклональных антител (mAb). Дезинфекция проводилась с использованием 0,1 М раствора NaOH в течение 30 минут за цикл, а после 140 циклов концентрация была увеличена до 0,5 М раствора NaOH. После каждого цикла проводилась регенерация сорбента. Каждые 10 циклов оценивались ключевые показатели эффективности, в том числе динамическая связывающая способность (ДСС), выход, профиль SEC, HCP и потеря р-белка А.
Результаты:
• После 200 циклов выход составил более 80 %, что соответствует ожидаемым стандартам производительности.
• Динамическая связывающая способность (ДСС) сохранила более 80 % от исходного значения.
• Анализ методом гель-проникающей хроматографии не выявил существенных изменений в чистоте продукта.
• Остаточное содержание ГХП не превышало 1000 частей на миллион.
• Потеря rProtein А не превышала 25 ppm.

Пример 2. Валидация жизненного цикла анионообменной смолы BioLink для очистки вирусов

При анионообменной хроматографии оценивалась способность сорбента удалять вирус лейкемии мышей (MuLV) и вирус мышей (MVM) в ходе многократных циклов повторного использования. Эффективность оценивалась на ранних, средних и поздних этапах срока службы сорбента. Перед загрузкой образцы были соответствующим образом подготовлены для эффективного связывания и выведения вирусов.

Экспериментальные результаты показали, что способность сорбента удалять вирусы не снижается после 150 циклов повторного использования.

Знакомство с центром по применению BioLink в г. Сучжоу
Центр прикладных исследований BioLink в Сучжоу занимает площадь 3000 квадратных метров и включает в себя сектор научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ, лабораторию клеточных культур, микробиологическую лабораторию, лабораторию очистки, экспериментальный цех и аналитическую лабораторию. Центр предоставляет клиентам услуги по разработке процессов на всех этапах, подготовке образцов в малых и экспериментальных масштабах, проверке срока службы сорбентов и техническому обучению.