Решения для очистки коллагена и обмен опытом

Коллаген — это биологическая макромолекула, которая обычно встречается у позвоночных. Он в большом количестве содержится в тканях и органах млекопитающих и обычно составляет 30 % от общего содержания белка в организме. В человеческом организме коллаген широко распространён в коже, костях, мышцах и других тканях. В основном он играет роль в поддержании, восстановлении и защите клеток тканей. Он также участвует в физиологических и биохимических процессах, таких как пролиферация, дифференцировка, миграция клеток и передача сигналов. Это ключевой структурный белок, который формирует каркас организма.

Хотя коллаген является одним из важнейших белков в организме человека, его состав и структура относительно просты. Это волокнистый белок, состоящий из нескольких проколлагеновых цепей. Проколлаген, являющийся основной единицей коллагена, состоит из трёх полипептидных цепей, а его первичная структура представляет собой (Gly-X-Y)n повторов, где X и Y обычно являются пролином и гидроксипролином, а также небольшим количеством лизина и гидрокси лизина. Три пептидные цепи проколлагена обвиваются друг вокруг друга за счёт межцепочечных водородных связей, образуя стабильную структуру тройной спирали (рис. 1). Стабильность конформации тройной спирали проколлагена зависит от сильной водородной связи, образованной гидроксильной группой гидроксипролина, которая может повышать прочность коллагена. Сочетание пролина и гидроксипролина может приводить к резкому скручиванию структуры тройной спирали коллагена и повышать его стабильность.


Рис. 1. Три пептидные цепи проколлагена переплетаются между собой с помощью межцепочечных водородных связей, образуя стабильную структуру тройной спирали.

Натуральный коллаген добывается из ограниченного числа источников. В основном его получают из коллагена наземных животных (например, свиной и коровьей кожи) и сырья для получения коллагена водных животных (например, рыбьей кожи, костей и чешуи) с помощью традиционных методов, таких как экстракция горячей водой, кислотно-щелочной гидролиз и ферментативный гидролиз. Из-за некоторых религиозных убеждений и риска заражения зоонозными заболеваниями люди начали искать другие, более безопасные и эффективные методы получения коллагена.

С быстрым развитием и становлением генной инженерии, белковой инженерии и других дисциплин ускорились и исследования рекомбинантного коллагена. По сравнению с традиционными методами экстракции продукты из рекомбинантного коллагена отличаются более высокой чистотой, стабильностью и безопасностью. С непрерывным развитием технологии получения рекомбинантного коллагена его доля на рынке также увеличивается с каждым годом (рис. 2).


Рис. 2. РАспределение китайского рынка коллагена в 2021–2027 годах
 (Источник изображения: Sullivan: отчёт об исследовании мирового рынка рекомбинантного коллагена III типа за 2025 год)

Анализ процесса производства рекомбинантного коллагена

В настоящее время фрагментный рекомбинантный коллагена на upstream этапе  в основном получают с помощью системы экспрессии прокариот/дрожжей, а полноразмерный рекомбинантный коллаген — с помощью системы экспрессии клеток млекопитающих (например, системы экспрессии клеток яичника китайского хомячка).

BioLink может предоставить биореакторы объёмом от 10 до 2000 литров, которые подходят для работы как в лабораторных, так и в промышленных масштабах. К ним относятся одноразовые биореакторы-качалки, одноразовые биореакторы с мешалкой и другие биореакторы, а также настольные стеклянные биореакторы, обычно используемые для разработки и оптимизации технологических процессов в лабораторных масштабах.

В последние годы хроматография начинает играть все более важную роль в области downstream очистки рекомбинантного коллагена. Теоретически, у большинства коллагенов PI ≥ 7,0, поэтому технология ионообменной хроматографии часто используется для очистки и приготовления коллагеновых продуктов. Катионообменная хроматография позволяет эффективно улавливать молекулы коллагена и быстро разделять целевые вещества и примеси, а анионообменная хроматография может использоваться для удаления следовых примесей, таких как эндотоксин, в проточном режиме. Кроме того, коллаген обладает хорошей гидрофобностью, поэтому для работы с коллагеном часто используются гидрофобные сорбенты.

Являясь поставщиком биофармацевтических препаратов с развитой технологией и широким охватом рынка, компании Biomirix и BioLink может предложить решения для downstream очистки в части основного оборудования и расходных материалов любого масштаба, включая сорбенты, хроматографические колонки и хроматографические системы.

Общая технологическая схема работы с рекомбинантным коллагеном

Рис. 3. Комплексное решение BioLink для производства рекомбинантного коллагена

Пример применения

Пример 1: разработка процесса очистки рекомбинантного коллагена (тип III)

Рис. 4. (Слева) Одностадийная очистка с помощью SP Chromstar® XL; (Справа) Схема тестирования с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ

В данном случае целевым белком является рекомбинантный фрагмент коллагена III типа массой 55 кДа, который секретируется и экспрессируется дрожжами. Для проекта требуется одностадийная очистка, чтобы чистота по результатам ВЭЖХ составляла ≥ 95 %. Via SP Chromstar® XL был очищен за один этап при загрузке 140 г/л, а чистота элюированного образца по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ составила 98,50%.

 Пример 2: разработка процесса очистки фрагментов рекомбинантного коллагена (тип V)

Рис. 5. (Слева) Профиль одностадийной очистки MaXtar® MMC HR; (Справа) Гель-электрофорез

В данном случае целевой белок экспрессируется дрожжами и представляет собой рекомбинантный фрагмент коллагена V типа размером 26,9 кДа. Для проекта требуется одностадийная очистка с чистотой ≥ 95 % и выходом ≥ 85 %. С помощью MaXtar® MMC HR была проведена одноэтапная очистка, в результате которой электрофоретическая чистота элюированного образца составила > 95 %, а выход — 90 %.

Случай 3. Разработка процесса очистки фрагментов рекомбинантного коллагена (типа I)

Рис. 6. (Слева) Профиль очистки с помощью MaXtar® MMC HR; (Справа) Хроматограмма ВЭЖХ с обращённо-фазовым разделением

В данном случае целевым белком является фрагмент рекомбинантного коллагена типа Ⅰ. После одностадийной очистки с помощью MaXtar® MMC HR чистота элюированного образца по данным ВЭЖХ с обращённо-фазовым разделением составила 95,09 %, а выход — 80 %.

Знакомство с центром по применению BioLink в Сучжоу

Центр занимает площадь 3000 кв. м и включает в себя офис исследований и разработок, лабораторию клеточных культур, микробиологическую лабораторию, лабораторию очистки, экспериментальный цех и аналитическую лабораторию. Прикладной центр в Сучжоу предоставляет клиентам услуги по разработке процессов на всех этапах, подготовке образцов в лабораторных и экспериментальных масштабах, валидации и обучению.