В связи с быстрым развитием биофармацевтической промышленности разработка эффективных и стабильных процессов очистки становится все более актуальной. Высокопроизводительная автоматизированная технология очистки позволяет проводить всеобъемлющий и эффективный анализ и оптимизацию хроматографических сорбентов, буферных растворов и параметров процесса. Это значительно повышает эффективность и надежность разработки процессов. В статье мы подробно рассмотрим основные цели и стратегии анализа на базе высокопроизводительной платформы очистки, а также проиллюстрируем процесс ее применения в реальных условиях.
Основные цели разработки высокопроизводительной платформы для очистки
- Сокращение цикла разработки: ускорение оптимизации параметров процесса и анализа сорбентов за счет параллельных экспериментов и технологий автоматизации.
- Сокращение затрат на разработку: снижение расхода образцов сорбентов, оптимизация использования ресурсов и снижение экономической нагрузки при разработке процесса.
- Повышение надёжности процесса: уточнение взаимосвязи между критическими параметрами процесса (CPP) и критическими атрибутами качества (CQA) с помощью планирования экспериментов (DOE) и анализа данных для повышения воспроизводимости и управляемости процесса.
- Широкая адаптивность: соответствие требованиям к процессу очистки новых биологических препаратов, таких как антитела, конъюгаты антител с лекарственными средствами (ADC), вирусные векторы и рекомбинантные белки.
Высокопроизводительная стратегия аналитики. Анализ сорбентов. Стратегия анализа для афинной хроматографии.
- Анализ характеристик целевого продукта: полная оценка структуры и аффинности целевого продукта, таких как тип метки рекомбинантного белка, структура терапевтического антитела и т. д.
- Первичный выбор сорбента: выбор типа аффинного сорбента в соответствии с характеристиками целевого продукта, например, аффинный сорбент, содержащий ионы никеля, для захвата рекомбинантного белка, содержащего гистидиновую метку, или аффинный сорбент, содержащий белок А или белок G, для захвата антител, содержащих полную структуру антитела.
- Предварительный скрининг: выберите для скрининга 3–4 аффинных сорбента и используйте методы платформенной хроматографии. Например, при аффинной хроматографии антител для элюирования целевого продукта обычно используется буферный раствор 100 мМ ацетат натрия — уксусная кислота / 100 мМ глицин, а также определяется выход и чистота целевого продукта.
- Оптимизация процесса: дальнейшая оптимизация сорбента на основе результатов предварительного скрининга, а также параметров процесса, таких как загрузка, выщелачивание и элюирование, в сочетании с соответствующим планом эксперимента DOE.
Стратегия анализа для ионообменной хроматографии.
- Определите цель процесса и изоэлектрическую точку целевого продукта. Изоэлектрическую точку целевого продукта можно определить, рассчитав последовательность целевого продукта или с помощью капиллярного изоэлектрического фокусирующего электрофореза.
- Выбор сорбента и режима: для очистки от примесей, изоэлектрическая точка которых ниже, чем у целевого продукта, можно использовать анионообменную хроматографию в режиме проточного элюирования. Для очистки от примесей, изоэлектрическая точка которых выше, чем у целевого продукта, обычно используется катионообменная хроматография в режиме связывания/элюирования.
- Метод скрининга: для высокопроизводительного скрининга с использованием сорбента в проточном режиме обычно применяется метод дисперсионного анализа в сочетании с 96-луночным планшетом. Скрининг с использованием колоночной хроматографии является предпочтительным методом скрининга с использованием сорбента в режиме связывания/элюирования.
Стратегия анализа для гидрофобной хроматографии
- Предварительный эксперимент по определению гидрофобности: гидрофобность целевой молекулы определяется с помощью предварительного эксперимента с высоким градиентом соли, а плотность гидрофобных лигандов оптимизируется с помощью градиентного элюирования, что позволяет предсказать гидрофобность целевого продукта.
- Оптимизация концентрации соли для загрузки: целевой продукт смешивается с гидрофобными сорбентами в системе с высоким содержанием соли и элюируется в условиях с низким содержанием соли. Таким образом, при оптимизации концентрации соли в качестве предварительной соли для загрузки обычно используется сульфат аммония.
- Скрининг сорбента: после предварительного определения типа лиганда и концентрации соли, необходимой для загрузки, для скрининга сорбента и оптимизации процесса можно использовать метод градиентного элюирования от высокой концентрации соли к низкой, а последующее элюирование можно оптимизировать до ступенчатого с помощью планирования эксперимента.
Стратегия анализа для гель-фильтрационной хроматографии
- Оценка молекулярной массы: общее представление о молекулярной массе целевого продукта и примесей, которое можно получить с помощью гель-электрофореза, капиллярного электрофореза и других методов.
- Выбор сорбента: основное внимание уделяется диапазону пор сорбента. Чем больше диаметр пор, тем шире диапазон разделения. Например, у Geldex® 75pg поры меньше, а диапазон разделения сорбента составляет 3–70 кДа, в то время как у Geldex® поры крупнее, а диапазон разделения сорбента составляет 10–600 кДа. Поэтому сначала необходимо выбрать подходящий сорбент в соответствии с потребностями в очистке.
- Специфическая адсорбция. Обратите внимание на специфический адсорбционный эффект сорбента в отношении целевого продукта и постарайтесь максимально снизить специфическую адсорбцию между целевым продуктом и сорбентом.
Анализ буферного раствора
- Выберите подходящий тип буфера, например фосфатный буфер, буфер Трис-HCl, ацетатный буфер и т. д., в зависимости от природы целевого белка и требований к его очистке.
- Разработка параметрического градиента Задайте значение pH, ионную силу, концентрацию соли и другие параметры буферного раствора в виде градиента. Например, значение pH можно установить на 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 и т. д., а ионную силу — на 0,1 М, 0,2 М, 0,3 М и т. д.
- Высокопроизводительные скрининговые эксперименты. Используйте буферные растворы с различными параметрами для этапов смешивания, загрузки, промывки и элюирования сорбента, а также подбирайте оптимальные условия, определяя чистоту, степень восстановления и удаления примесей белка.
Анализ параметров процесса
- Определение критических параметров таких как загрузка, скорость потока, градиент элюирования и т. д. Эти параметры оказывают существенное влияние на эффективность очистки и стабильность процесса.
- Разработка экспериментального протокола. Используйте методы планирования эксперимента, такие как ортогональный эксперимент и однофакторный эксперимент, комбинируйте и настраивайте ключевые параметры процесса для определения условий эксперимента.
- Оптимизация на основе данных. Проведите эксперимент на высокопроизводительной платформе, соберите результаты очистки при различных условиях эксперимента, проанализируйте данные и выберите наилучшее сочетание параметров процесса.
Пример применения: разработка процесса очистки секретируемого дрожжами белка
Секреторная экспрессия в супернатанте определенных дрожжей:- Молекулярная масса: 27 кДа,
- Изоэлектрическая точка: 9,90,
- Умеренная гидрофобность,
- Подбор подходящих экспериментальных условий с помощью высокопроизводительных методов,
- Подбор предварительных экспериментальных условий с помощью 96-луночных планшетов.
Сорбенты BioLink: MaXtar® S, SP Chromstar® FF, MaXtar® MMC, MaXtar® MMC HR, MaXtar® Phenyl HR, MaXtar® butyl HR.
Стратегия условий хроматографии
Буферный раствор для ионной хроматографии
A: PB+NaCl, pH7,0, 5 мСм/см;
B: PB+NaCl, pH7,5, 5 мСм/см;
C: PB+NaCl, pH 7,0, 7 мСм/см;
D: PB+NaCl, pH 7,5, 7 мСм/см;
E: PB+NaCl, pH 7,0, 9 мСм/см;
F: PB+NaCl, pH 7,5, 9 мСм/см.
Буферный раствор для гидрофобной хроматографии
G: PB, pH 7,0;
H: PB, pH 7,5;
I: PB, 0,5 М (NH4)2SO4, pH 7,0;
J: PB, 0,5 М (NH4)2SO4, pH 7,5;
K: PB, 1 М (NH4)2SO4, pH 7,0;
L: PB, 1 М (NH4)2SO4, pH 7,5;
M: PB, 1,5 М (NH4)2SO4, pH 7,0;
N: PB, 1,5 М (NH4)2SO4, pH 7,5.
На основе эффекта разделения и параметров управления процессом катионной хроматографии, композитной хроматографии и гидрофобной хроматографии была выбрана подходящая стратегия сочетания хроматографических методов, и, наконец, были оптимизированы буферный раствор и режим связывания/элюирования для определения оптимального процесса очистки белка.
