Методы очистки | Применение катионных мультимодальных сорбентов для очистки антител

В настоящее время широко используется традиционная катионообменная хроматография. Но у нее существуют недостатки: узкие рабочие диапазоны и ограниченная эффективность удаления примесей при работе со сложными образцами или при стремлении повысить надёжность процесса. Для решения этих проблем в качестве важного дополнения и даже альтернативы традиционной катионообменной хроматографии появилась мультимодальная хроматография. Благодаря сочетанию нескольких механизмов взаимодействия (таких как электростатические силы, гидрофобные взаимодействия и водородные связи) мультимодальная хроматография позволяет более эффективно удалять примеси в более широком диапазоне рабочих условий, сохраняя при этом высокий выход продукта.

В этой статье рассказывается о характеристиках и сферах применения катионных мультимодальных сорбентов серии BioLink MMC для очистки антител.

Серия катионных мультимодальных сорбентов

Сорбенты MaXtar® MMC (средний размер частиц: 90 мкм) и MaXtar® MMC HR (средний размер частиц: 40 мкм) содержат функциональные группы с различными свойствами: карбоксильные, водородные и гидрофобные. По сравнению с традиционными одномодальными хроматографическими сорбентами эти мультимодальные лиганды обладают сочетанием нескольких сил взаимодействия, что позволяет избирательно удалять различные примеси за один этап. Это приводит к более высокому уровню восстановления и превосходному качеству продукции, что обеспечивает значительные преимущества в производительности:

• Высокая связывающая способность экономит время и снижает затраты; более мелкие частицы HR обеспечивают более высокое разрешение.
• Широкий диапазон рабочих значений pH и электропроводности в процессах промышленного масштаба.
• Прочная матрица MaXtar® выдерживает высокое давление, что упрощает масштабирование.
• Благодаря превосходной устойчивости к воздействию солей MaXtar® MMC идеально подходит для этапов улавливания в процессах получения рекомбинантных белков, что снижает потребность в замене буфера.
• Высокая эффективность удаления примесей, особенно агрегатов, на промежуточных этапах или этапах полировки при очистке антител.

Способность связывания антител

• Объём колонки: 4,7 мл
• Образец: очищенный IgG1 (экспрессируемый в клетках CHO)
• Время пребывания в колонке: продолжительность загрузки образца: 5 мин
• Буфер для связывания: 50 мМ HAc-NaAc, pH 5,5

Рис. 1. Способность MaXtar® MMC связывать антитела

Краткое содержание: в режиме ионного связывания средняя связывающая способность: MaXtar® MMC: 50 мг/мл; MaXtar® MMC HR: 60 мг/мл

Характеристика устойчивости к солям

Рис. 2. Тест на устойчивость к соли MaXtar® MMC

Резюме: при ионном связывании с использованием буфера HAc–NaAc 50 мМ, pH 5,5 и постепенном увеличении концентрации NaCl IgG оставался хорошо связанным вплоть до 150 мМ NaCl (17 мСм/см).

Кривая зависимости давления от потока

Рис. 3. Кривая зависимости давления от расхода MaXtar® MMC

Рис. 4. Кривая зависимости расхода от давления MaXtar® MMC HR

Резюме: MaXtar® MMC и MaXtar® MMC HR демонстрируют превосходные механические характеристики. Вариант HR с более мелкими частицами сохраняет характеристики, подходящие для коммерческого применения, и при этом обеспечивает более высокое разрешение.

Пример применения 1: эффективное удаление агрегатов и фрагментов с помощью MaXtar® MMC HR в проекте по исследованию антител

Условия:

Образец	SEC purity			NE-CE purity
	HMW (%)	Monomer (%)	LMW (%)	HMW (%)	Monomer (%)	LMW (%)
Загрузка	6.43	79.58	13.99	5.55	75.58	18.87
Элюция	0.45	98.43	1.12	0.00	98.11	1.89

Резюме: после очистки с помощью MaXtar® MMC HR содержание агрегатов снизилось с 6,43 % до 0,45 %, а содержание фрагментов — с 13,99 % до 1,12 %. Результаты показывают, что MaXtar® MMC HR обеспечивает эффективное удаление как агрегатов, так и фрагментов.

Пример применения 2: удаление кислотного/щелочного пика с помощью MaXtar® MMC HR при очистке антител

Условия: 

• Сорбент: MaXtar® MMC HR, колонка 4,7 мл
• Нагрузка: образец при 3 мСм/см, pH 5,5 (<20 мг/мл) 
• Буфер A: 50 мМ NaAc–HAc, pH 5,5
• Буфер B: 50 мМ NaAc–HAc + 1 М NaCl, pH 5,5

Рис. 5. Профиль элюирования MaXtar® MMC HR

Рис. 6. Хроматограмма кислотно-щелочного пика  MaXtar® MMC HR

Образец	Выход (%)	Charge Variants
		Acidic Peak (%)	Main Peak (%)	Basic Peak (%)
Загрузка	/	45	53	2
Элюция	78	33	66	1

Резюме: результаты показывают, что MaXtar® MMC HR эффективно элюирует кислотный пик, затем — основной.

Руководство по выбору и практические советы

• Средний размер частиц MaXtar® MMC составляет 90 мкм, а MaXtar® MMC HR — 40 мкм. Помимо разницы в размере частиц, MMC HR отличается более низкой плотностью лигандов, чем MMC, что приводит к снижению прочности связывания. Если в процессе разработки наблюдается слишком сильное связывание, рекомендуется использовать MMC HR.
•  Для сильно гидрофобных образцов, если элюирование не может быть достигнуто с помощью стандартных условий по соли или pH с использованием серии MMC, рекомендуется использовать комбинированный градиент соли и pH.
• Если образец содержит большое количество примесей, связанных с продуктом, таких как агрегаты, фрагменты или варианты заряда, рекомендуется использовать более высокое разрешение MaXtar® MMC HR.
• При разработке процесса следует учитывать конкретные свойства образца и цели очистки. Особое внимание следует уделить достижению баланса между чистотой продукта и коэффициентом извлечения.