Знакомство с принципом очистки и параметрами продукта
В отличие от обычных сорбентов, сорбент HAP использует такие механизмы разделения, как анионообмен, катионообмен и хелатирование металлов, благодаря своей двухкомпонентной структуре Ca2+ и PO43-. Участки PO43- могут связываться с положительно заряженными белками посредством ионных связей, что характерно для катионообмена. Участки Ca2+ связываются с отрицательно заряженными карбоксильными группами свободных белков посредством хелатирования металлов или анионообмена.
Рис. 1. Схематическое изображение принципа связывания
|
Название сорбента |
BARONHAP® Тип I |
BARONHAP® Тип II |
|
Средний размер частиц |
40 мкм |
|
|
Лиганд |
Ca2+, PO43-, -OH |
|
|
Динамическая связывающая |
≥45 мг/г G1/мл хром. сорбента |
≥15 мг/г G1/мл Chromatography resin |
|
Плотность |
0.60~0.66 г/мл |
0.65~0.72 г/мл |
|
Макс. обратное давление |
3 MPa |
4 MPa |
|
Рекомендуемый поток |
50-400 cm/h |
|
|
pH стабильность (CIP) |
6.5-14 |
|
|
Устойчивость к растворителям |
Обычные фосфатные растворы, 1 М NaOH, 8 М мочевина, pH во время использования должен быть ≥ 6,5
|
|
|
Несовместимость |
EDTA, цитрат натрия |
|
|
Хранение |
0.1~0.5 M NaOH |
|
Таблица 1. BARONHAP® параметры
Показатели связывающей способности
Тест на способность к связыванию был проведен с использованием IgG1, полученного из клеток CHO, и основное связывание молекулы проявлялось в виде связывания фосфатной группы, BARONHAP® Тип I обладает большими преимуществами в отношении способности к связыванию.
Кривая скорости потока
Рис. 2. BARONHAP® Тип I
Кривая зависимости расхода от давления (D: 300 мм * H: 20 см)
Кейс применения №1
BARONHAP® Тип IЭффективное удаление агрегатов в проектах с антителами
Рекомендуемые технологические условия
Информация об образце: анион биспецифического антитела проходит через жидкость
Хроматографическая колонка: 10 * 250 мм, 20 мл
Буфер А: 20 мМ ПБ, 20 мМ Трис, pH 7,2
Буфер А: 20 мМ ПБ, 20 мМ Трис, 1 М NaCl, pH 7,2
Рис 3: BARONHAP® Type I хроматограмма
|
# |
Время |
|
Зона пика |
Высота пика |
Коэффициент симметрии
|
Площадь пика % |
Тип |
|
1 |
6.314 |
140.4 |
6.1 |
0.3511 |
1.611 |
0.478 |
BV E |
|
2 |
7.152 |
29207.6 |
1134.3 |
0.3864 |
0.738 |
99.522 |
VB R |
Резюме: BARONHAP® тип I показал хорошие результаты при работе с биоспецифическимиантителами: его связывающая способность составила 36,9 г/л, чистота увеличилась с 91,8 % до 99,5 %, содержание агрегатов снизилось с 6 % до 0,5 %, а выход достиг 86 %.
Пример применения 2
BARONHAP® Тип II, 40 мкмПрименение в рекомбинантных факторах
Рис 4: BARONHAP® Type II Elution Profile
Рис 5: Type II elution profile of company B
|
Сорбент |
Концентрация (мг/мл) |
Объем (мл) |
Всего (мг) |
Выход (%) |
HCP (ppm) |
SEC-HPLC (%) |
|
BARONHAP® Type II |
0.422 |
25.81 |
10.9 |
50.9 |
929.1 |
94.9 |
|
Company B Type II |
0.458 |
23.92 |
11.0 |
51.3 |
917.9 |
92.1 |
Резюме: по сравнению с синхронным тестированием импортных конкурентов производительность сопоставима.
Часто задаваемые вопросы
Вопрос 1.Какие меры предосторожности следует соблюдать при упаковке колонны?
Ответ: Не используйте чистую водную фазу и требуйте, чтобы колонка была заполнена буфером с определённой ионной силой. Для проверки эффективности колонки рекомендуется провести тест с загрузкой солью.
Вопрос 2.
Какие буферные растворы можно использовать с HAP?
Ответ: Обычно используется 5 мм фосфатный буфер для связывания, рН 6,8. Щелочные белки можно элюировать линейно или поэтапно с помощью 1 М фосфатного буфера NaCl, рН 7,2. Кислые белки можно элюировать линейно или поэтапно с помощью 500 мм фосфатного буфера. Очень важно, чтобы рН как связующего, так и элюирующего буфера был выше 6,5.
Вопрос 3.
Как продлить срок службы HAP сорбента?
Ответ: Рекомендуется, чтобы все буферные растворы, в том числе растворы для хранения, содержали не менее 5 мМ фосфата и имели pH не ниже 6,5. Старайтесь выбирать буферы с высоким pH для всех задач. Добавление ионов кальция в количестве, близком к молярной концентрации, может повысить прочность смолы. При первом использовании элюирования с помощью NaCl pH снижается из-за высвобождения ионов водорода, поэтому добавление дополнительного буфера, например MES, значительно повысит прочность смолы. Обработка колонки раствором NaOH предотвращает осаждение карбоната на поверхности колонки. Избегайте резких изменений потока, чтобы уменьшить воздействие давления, которое может привести к разрушению слоя колонки. После промывки щелочью рекомендуется добавить промывку с высоким содержанием соли для полного отверждения.
Вопрос 4.
Каков срок службы и срок годности при хранении?
Ответ: При правильной упаковке и поддержании pH выше 6,5 HAP можно использовать не менее 40 циклов. Если соблюдать осторожность, чтобы не повредить сорбент, HAP можно повторно упаковывать 20 и более раз. При хранении в закрытых контейнерах при температуре 4-30 °C сорбент может храниться в течение 5 лет.
Вопрос 5.
Какой опыт расширения производства имеется у HAP в настоящее время? Какова максимальная производительность одной партии в настоящее время?
Ответ: Максимальный размер колонки составляет 450 мм, а высота слоя в колонке — около 20 см. Максимальная производительность за один цикл — 50 кг.
