Руководство к действию: выбор хроматографического сорбента

Разрешение, селективность и связывающая способность различных сорбентов определяют эффективность разделения, а также влияют на успех всего эксперимента. Аффинная, ионообменная, гидрофобная, мультимодальная, обращенно-фазовая, гель-фильтрационная и другие виды хроматографии имеют свои преимущества и подходят для разных этапов очистки. Следующая таблица поможет вам быстро сравнить и выбрать наиболее подходящий вариант.

Таблица 1. Характеристики различных хроматографических сорбентов и их применение на этапе очистки

Аффинная хроматография обладает наилучшей селективностью благодаря своей способности специфически связываться с целевым белком, но не с другими белками-примесями. Однако аффинная хроматография подходит не для всех методов очистки белков и невозможно создать аффинный хроматографический сорбент для каждого целевого белка. Существует множество готовых аффинных хроматографических сорбентов для широко используемых типов, таких как His, Fc, GST и т. д. Аффинная хроматография — лучший метод очистки белков в научных исследованиях. Для некоторых белков с низким уровнем экспрессии, которые трудно очистить, во время экспрессии можно добавить несколько типов для очистки и использовать двухэтапную аффинную хроматографию.

При использовании аффинной хроматографии необходимо понимать принцип аффинности. В зависимости от факторов, которые могут повлиять на эффективность очистки, можно оптимизировать подготовку образца, выбор буфера, этапы хроматографии и другие аспекты процесса хроматографии. В качестве примера можно привести His-меченый белок, который помогает нам лучше понять, как на практике работает аффинная хроматография. Имидазольная группа в боковой цепи гистидина (His) может образовывать координационные связи с различными ионами металлов (такими как Ni2 +, Co2 +, Cu2 +, Zn2 + и т. д.) и избирательно связываться с ними. Среди них Ni2 + является предпочтительным ионом металла для очистки His-меченого белка, а также наиболее широко используемым ионом металла. В настоящее время широко используются аффинные хроматографические сорбенты на основе четырёхвалентных хелатных соединений NTA и пятивалентных хелатных соединений TED. Среди них ионы Ni, хелатированные в форме TED, чрезвычайно стабильны, устойчивы к воздействию восстановителей и хелатирующих агентов, таких как ЭДТА, и подходят для работы с супернатантами экспрессии клеток млекопитающих, прямой загрузки и очистки, а также загрузки раствора для ренатурации с восстановителем. При выборе других ионов металлов для очистки можно использовать сорбент IMAC, который сама хелатирует ионы металлов, а затем очищает их.

Сорбент	Способ хелатирования	Принцип	Преимущества
Ni Chromstar® FF	NTA	Четырехвалентное хелатирование	Крупный размер частиц, низкое противодавление, широкое применение
Ni Chromstar® HR	NTA	Четырехвалентное хелатирование	Мелкие частицы, высокая связывающая способность, широкое применение
IMAC Chromstar® FF	NTA	Четырехвалентное хелатирование	Может самостоятельно связывать ионы металлов
Ni Chromstar® Excel	TED	Пятивалентное хелатирование	Устойчив к воздействию восстановителей, хелатирующих агентов и щелочей низкой концентрации

Таблица 2. Характеристики сорбентов в различных хелатных формах BioLink

При использовании аффинности к Ni обратите внимание на то, что ионы металлов имеют положительный заряд. Чтобы избежать неспецифического связывания, в буфер следует добавить определённую концентрацию NaCl. В то же время можно добавить имидазол в низкой концентрации, чтобы предотвратить неспецифическую адсорбцию, в которой преобладает non-His-метка. После загрузки и смешивания образца необходимо выбрать подходящую концентрацию имидазола для промывки, чтобы удалить примеси белка со слабым неспецифическим связыванием и повысить концентрацию целевого белка в элюате.

Пример 1: очистка рекомбинантного коллагена

Образец: Рекомбинантный коллаген
Колонка: Ni Chromstar Excel (0,77 * 10 см, объем колонки (CV) = 4,7 мл)
Буфер А: 20 мм PB + 0,15 М NaCl (рН 7,5)
Буфер В: 20 мм PB + 0,15 М NaCl (рН 7,5) + 0,5 м имидазола (рН 7,5)

Этап	Фаза	Объем колонки (CV)	Линейный поток (cm/h)	Объемный расход (ml/min)
Уравновешивание	Буфер A	10	127.5	1
Загрузка	Образец	20	127.5	1
Пост-уравновешивание	Буфер A	5	127.5	1
Washing	90% буфер A+10% буфер B	5	127.5	1
Элюция	Буфер  B	5	127.5	1

Таблица 3. Подробные этапы очистки рекомбинантного коллагена



Рисунки 1 и 2: Хроматограмма NI сорбент и диаграмма геля

Общие проблемы	Возможные проблемы	Решение
Белок не связывается с колонкой	Его метка потеряна Образец или буфер для связывания не соответствуют требованиям Гистидиновая метка не полностью обнажена	При необходимости увеличьте количество His-меток (обычно 6–10)   Проверьте pH и состав образца и буферного раствора для связывания  Очистите в денатурирующих условиях (используя 8 М мочевину, 6 М гуанидин гидрохлорид, 1 % додецилсульфата натрия) и добавьте 1–2 мМ дитиотреитола
Белок связывается с колонкой, но не может быть элюирован	Условия элюирования слишком мягкие Белок подвергается неспецифической адсорбции на колонке Белок осаждается на колонке	Для поиска оптимальных условий элюирования используйте градиентное элюирование с повышением концентрации имидазола или снижением pH. Добавьте в буфер для элюирования неионогенный детергент (например, 2 % Triton X-100) или увеличьте концентрацию NaCl. Уменьшите количество образца и время инкубации, используйте детергент (1 %–2 % Triton X-100) или измените концентрацию NaCl и т. д.
Слишком много полос примесей	У примесных белков слишком сильное сродство к никелевому стержню Примесные белки связываются с целевым белком	Увеличьте начальную концентрацию имидазола, чтобы белки-примеси связались с никелевой колонкой.  Эту проблему можно решить, добавив моющее средство (1–2 % Triton X-100) перед обработкой ультразвуком.

Таблица 4. Распространённые проблемы при очистке белков

Если после аффинной очистки чистота недостаточна, можно провести финишную очистку с помощью ионообменной, гидрофобной, мультимодальной или гель-фильтрационной хроматографии.
Выберите метод хроматографии в зависимости от разницы в свойствах целевого белка и белка-примеси:

• Ионообменная хроматография: большая разница в изоэлектрических точках
• Гидрофобная хроматография: большая разница в гидрофобности
• Гель-фильтрационная хроматография: большая разница в молекулярной массе
• Мультимодальная хроматография: ионообменная хроматография и хроматография на основе гидрофобных взаимодействий сами по себе не могут обеспечить эффективное разделение
• Обращённо-фазовая хроматография: обычно не используется для очистки белков, но может применяться для очистки низкомолекулярных полипептидов

Среди этих методов ионообменная хроматография наиболее удобна в использовании и широко применяется. Это предпочтительный метод очистки, помимо аффинной хроматографии. Особенно когда различия в свойствах белков до конца не изучены, этот метод можно использовать в первую очередь для тестирования. Различия в молекулярной массе обычно можно найти на странице результатов SDS, а в аффинных образцах также часто встречаются примеси меченых белковых фрагментов.

Поэтому гель-фильтрационная хроматография также широко используется в научных исследованиях. Все методы очистки, за исключением гель-фильтрационной хроматографии, связаны с изменением рН или электропроводности. При выборе метода хроматографии в первую очередь следует учитывать стабильность целевого белка, а также определить дополнительный метод хроматографии и рабочий диапазон.

Метод	Продукт
Гель-фильтрационная хроматография	·Chromstar® 4FF/6FF ·Chromstar® CL-4B/CL-6B ·Chromstar® 4B/6B ·Geldex® PG ·Puredex® G ·Puredex® LH-20
Ионообменная хроматография	·MaXtar® Q/DEAE/S ·MaXtar® Q/SP HR ·Q/SP Chromstar® BB ·Q/DEAE/SP/S/CM ·Chromstar® FF·Q/DEAE/SP/CM Chromstar® HP ·Q/SP Chromstar® XL ·DEAE Puredex® A50
Хроматография гидрофобного взаимодействия	·MaXtar® Butyl/Phenyl HS ·MaXtar® Phenyl/Butyl HR ·Phenyl Chromstar® 6FF(HS)/(LS) ·Octyl/Butyl/Butyl-S Chromstar® 4FF ·Phenyl/Butyl Chromstar® HP
Мультимодальная хроматография	·MaXtar® MMC ·MaXtar® MMC HR

Таблица 5. Компания BioLink предлагает широкий выбор хроматографических сорбентов и предварительно заполненных колонок.
Продукты, выделенные жирным шрифтом, подходят для использования в научных исследованиях.

Используя ионный обмен в качестве примера, когда целевой белок имеет суммарный положительный заряд (рН раствора ниже PI), его можно комбинировать с сорбентом для катионообменной хроматографии (S, SP, CM); Также его можно комбинировать с сорбентом для анионообменной хроматографии (Q, DEAE) для выбора подходящих условий рН и  хроматографического сорбента в соответствии со стабильным диапазоном рН белка и максимального увеличения разницы в заряде между целевым белком и белком-примесью. Образцы должны связываться при низкой электропроводности и элюироваться при увеличении концентрации соли или изменении рН. В ходе первоначального эксперимента после связывания белка его можно постепенно перевести из раствора с низкой электропроводностью в раствор с высокой электропроводностью с помощью линейного градиента, чтобы повысить разрешающую способность и найти подходящие условия для удаления примесей и элюирования целевого белка.

Пример 2: очистка коллагена с SP Chromstar® FF

Образец: коллаген I типа
Молекулярная масса: 300–400 кДа
Изоэлектрическая точка: 7–9 (теоретическая) 
Источник: экспрессия в клетках CHO
Эквиilibration: 50 мМ HAc-NaAc, pH 4,0, Cond 7,0 мСм/см
Элюирование: 50 мМ HAc-NaAc + 1 М NaCl, pH 4,0
RT = 5 минут

Рис. 3. Хроматография коллагена I типа

Гелевые хроматографические сорбенты разделяют белки по разнице в молекулярной массе, и на них обычно не влияют условия раствора. Однако между гелевыми хроматографическими сорбентами и белками происходит слабый ионный обмен. Как правило, для защиты в образцы и растворы добавляют определённую концентрацию соли. Чтобы добиться лучшего разрешения, объём загрузки обычно не превышает 5 % от объёма колонки.

Пример 3: опреснение с Puredex® G-25M

Сорбент: Puredex® G-25M
Колонка: Chrom-LinX® 26/400 (H = 34 см), объём колонки 170 мл
Образец: образец белка (~ 750 кДа)
Объём образца: 20 мл, 12 % от объёма колонки
Скорость потока: 8 мл/мин, 90 см/ч
Буфер: 10 мМ уксусная кислота — ацетат натрия, pH 6,0


Рис. 5. Хроматограмма образца белка

Подводя итог, можно сказать, что аффинная хроматография является предпочтительным методом очистки белков в научных исследованиях, а ионообменная хроматография и гель-фильтрационная хроматография также имеют множество применений. Не существует единой парадигмы процесса очистки, и в зависимости от целевого белка и примесей необходимо выбирать различные режимы хроматографии для их комбинации. Из-за ограниченного объёма статьи мы не можем подробно описать каждый метод хроматографии. Компания Biomirix предоставит техническую поддержку и помощь в выборе продукции в любое время.