Факторы, влияющие на гидрофобные хроматографические сорбенты
1. Гидрофобные свойства сорбентаГидрофобность — важный фактор при выборе сорбента, который в основном определяется типом лиганда (фенил > октил > бутил > бутил-S), плотностью лиганда и матрицей. Гидрофобность также напрямую влияет на степень извлечения целевого белка. Компания BioLink составила рейтинг гидрофобности существующих популярных сорбентов.
Рис. 1. Гидрофобность сорбентов BioLink от слабой к сильной
2. Выбор солевого раствора
Согласно принципу гидрофобной хроматографии, различные солевые растворы и их концентрация могут напрямую влиять на количество гидрофобных лигандов на молекулярной поверхности, тем самым воздействуя на взаимодействие между целевым белком и гидрофобным сорбентом. Поэтому выбор солевых растворов обычно проверяется и оптимизируется на начальном этапе.
Солевой раствор (элюирующая способность):
NaSO4＞KH2PO4＞Na2HPO4＞（NH4)2SO4＞K2CO3＞Na2CO3＞NaCl＞NaNO3
3. Влияние температуры
Как правило, с повышением температуры усиливается гидрофобное взаимодействие и увеличивается способность к связыванию. С понижением температуры гидрофобное взаимодействие ослабевает и способность к связыванию снижается. Во время разработки процесса следует поддерживать температуру, соответствующую температуре при большем масштабе, чтобы избежать чрезмерной разницы температур и нестыковок при масштабировании.
4. Выбор добавок
При гидрофобной хроматографии часто бывает так, что количество целевого белка в элюате невелико или он вообще не элюируется. Поэтому использование добавок в процессе элюирования является распространённым способом улучшить растворимость белка и способствовать его элюированию. К распространённым добавкам относятся органические растворители (изопропанол, этиленгликоль и т. д.), поверхностно-активные вещества, аминокислоты (аргинин) и т. д.
Применение гидрофобных сорбентов
Применение №1Название: MaXtar® Phenyl HR
Объём колонки: 4,7 мл
Целевой белок: BsAb (130 мС/см)
Связывающая способность: 30 мг/мл
Буфер для уравновешивания: 20 мМ трис-HCl, 1 М (NH4)2SO4, pH 7,4
Элюирующий буфер: 20 мМ Трис-HCl, pH 7,4
Рис. 2. Хроматограмма MaXtar® Phenyl HR
| Sample Name | SEC Purity | ||
| HMW(%) | Monomer(%) | LMW(%) | |
| Load | 4.59 | 95.41 | 0.0 |
| Elution | 0.59 | 99.4 | 0.0 |
Таблица 1: MaXtar® Phenyl HR до и после очистки
SEC _ HPLC (%) Результаты
Применение 2
Название сорбента: Phenyl Chromstar® HP
Объём колонки: H = 15 см, D = 26 мм
Целевой белок: вакцина против опоясывающего герпеса (VZV) (90–105 мСм/см)
Буфер для уравновешивания: PBS, 0,6 М (NH4)2SO4
Буфер для элюирования: очищенная вода
Рис. 3. Хроматограмма Phenyl Chromstar® HP
| Sample Name | SEC Purity | ||
| HMW(%) | Monomer(%) | LMW(%) | |
| Elution | 2.0 | 98.0 | 0.0 |
Таблица 2: Phenyl Chromstar® до и после очистки
SEC _ HPLC (%) Результаты
Резюме
Применение 1: после очистки биспецифического антитела с помощью MaXtar® Phenyl HR, SEC _ ВЭЖХ (%) увеличилась с 95,41 % до 99,4 %, а содержание высокополимерных соединений снизилось на 4 %, что свидетельствует о значительном эффекте удаления высокополимерных соединений.
Применение 2: после очистки вакцины против опоясывающего герпеса с помощью Phenyl Chromstar® HP, SEC _ ВЭЖХ (%) достигла 98 %, что свидетельствует о значительном эффекте очистки.
Советы по применению гидрофобных сорбентов
1. Выбор гидрофобных сорбентов
Гидрофобный лиганд можно выбрать в зависимости от свойств целевого белка и его гидрофобности. Если вы не знаете свойств целевого белка, для тестирования можно отдать предпочтение фенильному лиганду. В зависимости от конкретной ситуации подумайте, стоит ли заменять сорбентов.
2. Выбор загрузочного буфера
Обычно в гидрофобных буферах используются растворы солей (NH4)2SO4 и NaCl. Общий диапазон концентраций (NH4)2SO4 составляет 0,5–1,5 М (NH4)2SO4, а общий диапазон концентраций NaCl — 3 М NaCl. Раствор соли можно выбрать в зависимости от конкретных условий.
3. Оптимизация процесса элюирования
Гидрофобные сорбенты элюируются линейно, и процесс корректируется в зависимости от ситуации с элюированием. Если элюированный целевой белок хорошо отделяется от гетеробелка, можно попробовать одноступенчатое элюирование. Если разделение плохое, можно уменьшить линейный диапазон и наклон для улучшения разделения. Если элюируемый белок плохо элюируется или элюируется с трудом, можно оптимизировать процесс с помощью добавок или изменения солевого раствора.
