Вирусные векторы — это широко используемые в молекулярной биологии инструменты, предназначенные для доставки генетического материала в клетки живых организмов или клеточных культур. Принцип их действия заключается в использовании естественной способности вируса доставлять свой геном в другие клетки для инициации инфекции. Эти векторы широко применяются в фундаментальных исследованиях, генной терапии и производстве вакцин.
В настоящее время несколько вирусов были преобразованы в клинически одобренные системы доставки лекарств для человека. К основным вирусным векторам, которые обычно используются в клинической практике или клинических исследованиях, относятся аденовирус (AdV), аденоассоциированный вирус (AAV), ретровирус (RV), лентивирус (LV), вирус простого герпеса (HSV) и другие. Процесс фильтрации на downstream этапах обработки этих вирусных векторов показан ниже:
Очистка вирусных частиц — сложная задача. Downstream очистка требует удаления таких примесей, как ДНК клетки-хозяина (HCD), белки клетки-хозяина (HCP), плазмидная ДНК, а также решения проблем, связанных с агрегацией вирусных частиц, разрушением оболочки, наличием пустых/полных частиц и стабильностью.
При сборе вируса для лизиса клеток-хозяев используются физические или химические методы, обычно с применением детергентов, таких как Tween или Triton. AAV высвобождается из лизированных клеток-хозяев и фильтруется через глубинные фильтры. Остаточные фрагменты нуклеиновых кислот расщепляются с помощью нуклеаз при тщательном контроле температуры и продолжительности процесса, чтобы фрагменты нуклеиновых кислот были укорочены до размера менее 200 bp. Затем процесс переходит в стадию тангенциальной поточной фильтрации (tff) для замены буфера и концентрирования. При этом необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать чрезмерного концентрирования, которое может привести к агрегации вирусных частиц. Как правило, коэффициент концентрирования не должен превышать 10 раз, а сила сдвига должна быть низкой, чтобы не нарушить активность вируса. Половолоконный фильтр TFFNOVA от BioLink идеально подходит для этого процесса благодаря своей асимметричной структуре, которая снижает неспецифическую адсорбцию, увеличивает скорость и поток фильтрации, а также сокращает время фильтрации.
При работе сAAV рекомендуется использовать MaXtar AAV и Maxgo AAV. Для предотвращения агрегации вирусов или их прилипания к стенкам канала можно добавить такие вещества, как аргинин и глицерин. Для финишной очистки можно использовать MaXtar Q, чтобы удалить примеси, в том числе HCP и HCD. Эффективность разделения частиц можно повысить с помощью таких добавок, как MgSO4 или Na2SO4. На этом этапе требуется низкая электропроводность образца, чтобы обеспечить полное связывание вирусных частиц с колонкой и предотвратить прорыв. MaXtar Q — это сильный анионообменный хроматографический сорбент с улучшенными характеристиками по сравнению с традиционными сорбентами, обеспечивающий более высокую скорость технологического процесса и лучшую динамическую связывающую способность. Заключительные этапы включают в себя TFF для замены буфера, а затем стерилизующую фильтрацию для завершения подготовки конечного продукта.
Процесс очистки аденовируса отличается от процесса очистки AAV этапами хроматографии. Из-за большего размера частиц (обычно 70–90 нм) на первом этапе хроматографии обычно используется анионообменная хроматография с использованием MaXtar® Q для улавливания вирусных частиц и удаления некоторых примесей. На втором этапе проводится очистка с использованием многорежимной хроматографии с использованием MaXtar® COLL 400/700, которая эффективно удаляет HCD, HCP и другие примеси. MaXtar® COLL 400/700 предназначен для работы с крупными молекулами и позволяет легко отделять вирусные частицы от более мелких примесей, обеспечивая повышенную производительность с точки зрения скорости потока и масштабируемости процесса. Заключительный этап включает систему TFF для замены буфера, стерилизующую фильтрацию и подготовку конечной вирусной суспензии.
Векторы на основе лентивируса (LV) / вируса простого герпеса (HSV)
Векторы на основе лентивируса, полученного из HIV-1, высокоэффективны при доставке целевых генов в первичные клетки или клеточные линии и способны инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Векторы на основе ВПГ, разновидности онколитического вируса, могут специфически инфицировать и разрушать опухолевые клетки, не затрагивая нормальные клетки. Однако и лентивирус, и ВПГ являются оболочечными вирусами, и их оболочки подвержены воздействию сдвигающих сил во время очистки, что может существенно повлиять на вирусную активность. Кроме того, эти вирусы имеют более крупные размеры частиц — около 100–200 нм или даже до 300 нм. Для очистки этих крупных вирусных частиц требуются специальные методы хроматографии. Для эффективного отделения крупных вирусных частиц от более мелких примесей предпочтительна многорежимная хроматографическая смола MaXtar® COLL 400/700.
На этапе TFF из-за чувствительности вирусной оболочки к сдвиговым нагрузкам рекомендуется поддерживать скорость сдвига ниже 3000 1/с. Для этого этапа идеально подходит половолоконный модуль TFFNOVA® от BioLink в сочетании с настольной полуавтоматической системой TFF FiltraLinX®.
Выше описаны ключевые моменты и проблемы, связанные с очисткой основных вирусных векторов. При очистке различных вирусных частиц важно гибко подходить к выбору сорбентов и корректировать последовательность процессов, чтобы конечный продукт соответствовал стандартам контроля качества, в том числе по титру, чистоте и отсутствию примесей.
Очистка вирусных частиц — сложная задача. Downstream очистка требует удаления таких примесей, как ДНК клетки-хозяина (HCD), белки клетки-хозяина (HCP), плазмидная ДНК, а также решения проблем, связанных с агрегацией вирусных частиц, разрушением оболочки, наличием пустых/полных частиц и стабильностью.
Вектор аденоассоциированного вируса (AAV)
AAV — это непатогенный вирус, известный своей безопасностью и физической стабильностью. Он способен стабильно экспрессировать чужеродные гены в течение длительного времени, что делает его широко используемым вектором в генной терапии [1].При сборе вируса для лизиса клеток-хозяев используются физические или химические методы, обычно с применением детергентов, таких как Tween или Triton. AAV высвобождается из лизированных клеток-хозяев и фильтруется через глубинные фильтры. Остаточные фрагменты нуклеиновых кислот расщепляются с помощью нуклеаз при тщательном контроле температуры и продолжительности процесса, чтобы фрагменты нуклеиновых кислот были укорочены до размера менее 200 bp. Затем процесс переходит в стадию тангенциальной поточной фильтрации (tff) для замены буфера и концентрирования. При этом необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать чрезмерного концентрирования, которое может привести к агрегации вирусных частиц. Как правило, коэффициент концентрирования не должен превышать 10 раз, а сила сдвига должна быть низкой, чтобы не нарушить активность вируса. Половолоконный фильтр TFFNOVA от BioLink идеально подходит для этого процесса благодаря своей асимметричной структуре, которая снижает неспецифическую адсорбцию, увеличивает скорость и поток фильтрации, а также сокращает время фильтрации.
При работе сAAV рекомендуется использовать MaXtar AAV и Maxgo AAV. Для предотвращения агрегации вирусов или их прилипания к стенкам канала можно добавить такие вещества, как аргинин и глицерин. Для финишной очистки можно использовать MaXtar Q, чтобы удалить примеси, в том числе HCP и HCD. Эффективность разделения частиц можно повысить с помощью таких добавок, как MgSO4 или Na2SO4. На этом этапе требуется низкая электропроводность образца, чтобы обеспечить полное связывание вирусных частиц с колонкой и предотвратить прорыв. MaXtar Q — это сильный анионообменный хроматографический сорбент с улучшенными характеристиками по сравнению с традиционными сорбентами, обеспечивающий более высокую скорость технологического процесса и лучшую динамическую связывающую способность. Заключительные этапы включают в себя TFF для замены буфера, а затем стерилизующую фильтрацию для завершения подготовки конечного продукта.
Аденовирусный вектор (ADV)
Это вирусная система доставки генов, основанная на модифицированных аденовирусах человека или животных, лишённых репликационной способности. Они обладают высокой эффективностью заражения, инфицируют как делящиеся, так и неделящиеся клетки и имеют большую загрузочную способность. Они также не представляют риска случайной интеграции в геном человека и демонстрируют быструю транскрипционную экспрессию. Аденовирусные векторы легко масштабировать для промышленного производства, они обладают высокой иммуногенностью, что делает их полезными в качестве векторов для вакцин.Процесс очистки аденовируса отличается от процесса очистки AAV этапами хроматографии. Из-за большего размера частиц (обычно 70–90 нм) на первом этапе хроматографии обычно используется анионообменная хроматография с использованием MaXtar® Q для улавливания вирусных частиц и удаления некоторых примесей. На втором этапе проводится очистка с использованием многорежимной хроматографии с использованием MaXtar® COLL 400/700, которая эффективно удаляет HCD, HCP и другие примеси. MaXtar® COLL 400/700 предназначен для работы с крупными молекулами и позволяет легко отделять вирусные частицы от более мелких примесей, обеспечивая повышенную производительность с точки зрения скорости потока и масштабируемости процесса. Заключительный этап включает систему TFF для замены буфера, стерилизующую фильтрацию и подготовку конечной вирусной суспензии.
Векторы на основе лентивируса (LV) / вируса простого герпеса (HSV)
Векторы на основе лентивируса, полученного из HIV-1, высокоэффективны при доставке целевых генов в первичные клетки или клеточные линии и способны инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Векторы на основе ВПГ, разновидности онколитического вируса, могут специфически инфицировать и разрушать опухолевые клетки, не затрагивая нормальные клетки. Однако и лентивирус, и ВПГ являются оболочечными вирусами, и их оболочки подвержены воздействию сдвигающих сил во время очистки, что может существенно повлиять на вирусную активность. Кроме того, эти вирусы имеют более крупные размеры частиц — около 100–200 нм или даже до 300 нм. Для очистки этих крупных вирусных частиц требуются специальные методы хроматографии. Для эффективного отделения крупных вирусных частиц от более мелких примесей предпочтительна многорежимная хроматографическая смола MaXtar® COLL 400/700.|
Образец |
Поток (мл/мин) |
Объем (мл) |
Титр вируса (PFU/мл) |
HCP Residue ≤ 2000 ng/mL |
Recovery Rate (%) |
|
Раствор
|
2 |
10 |
1.00×108 |
меньше лимита обнаружения |
- |
|
После очистки (проточный режим)
|
2 |
20 |
4.05×107 |
370.12 |
81 |
На этапе TFF из-за чувствительности вирусной оболочки к сдвиговым нагрузкам рекомендуется поддерживать скорость сдвига ниже 3000 1/с. Для этого этапа идеально подходит половолоконный модуль TFFNOVA® от BioLink в сочетании с настольной полуавтоматической системой TFF FiltraLinX®.
Выше описаны ключевые моменты и проблемы, связанные с очисткой основных вирусных векторов. При очистке различных вирусных частиц важно гибко подходить к выбору сорбентов и корректировать последовательность процессов, чтобы конечный продукт соответствовал стандартам контроля качества, в том числе по титру, чистоте и отсутствию примесей.
