Плазмиды: терминология
Плазмиды — это небольшие кольцевые молекулы ДНК, которые существуют в бактериях независимо от хромосомной ДНК. Они широко используются в генной инженерии в качестве векторов для введения чужеродных генов в клетки-хозяева (клетки-мишени). Конструкция плазмид имеет решающее значение, поскольку она определяет их способность к трансфекции в клетки, что влияет на успех доставки генов. Плазмиды являются основополагающими инструментами в редактировании генов, производстве рекомбинантных белков и разработке методов клеточной и генной терапии.
Ключевые факторы при проектировании плазмид
- Размер и состав: Размер плазмиды может напрямую влиять на эффективность её трансфекции. Меньшие по размеру плазмиды, как правило, более эффективно проникают в клетки, тогда как при трансфекции более крупных плазмид могут возникать сложности. Состав плазмиды, в том числе наличие постороннего генетического материала, также может влиять на её рабочие характеристики. Тщательное проектирование гарантирует, что плазмиды содержат только необходимые генетические элементы, что позволяет оптимизировать их функционирование.
- Выбор промотора: Промоторы — это последовательности, инициирующие транскрипцию вставленного гена. Выбор промотора может влиять на уровень и продолжительность экспрессии гена. Выбор подходящего промотора является критически важным аспектом проектирования плазмиды, который должен быть адаптирован к специфическим требованиям конкретного применения.
- Точка начала репликации (ориджин репликации, origin of replication) — это последовательность, позволяющая плазмиде самостоятельно реплицироваться внутри клетки-хозяина. Выбор точки может влиять на количество копий плазмиды, что, в свою очередь, сказывается на уровнях экспрессии генов.
- Селективные маркеры: Селективные маркеры — это гены, придающие устойчивость к антибиотикам, что позволяет отбирать успешно трансфицированные клетки. Включение селективных маркеров является распространенной практикой при конструировании плазмид, облегчающей идентификацию клеток, которые приняли плазмиду.
- Промотор: промотор — это последовательность ДНК, определяющая экспрессию гена интереса (GOI). Уровень экспрессии GOI зависит от типа клетки и промотора. В рамках нашего предложения «Easy Plasmid» мы предлагаем на выбор восемь различных промоторов, которые подойдут для ваших нужд.
Технологии конструирования плазмид
- Традиционные методы клонирования. Традиционное клонирование включает расщепление ДНК рестриктазами и лигирование для вставки фрагментов ДНК в плазмиды. Рестриктазы расщепляют ДНК в определённых, строго заданных участках — сайтах рестрикции., а фрагменты соединяются с помощью ДНК-лигазы. В качестве альтернативы можно использовать методы, основанные на ПЦР. ПЦР позволяет амплифицировать интересующий ген и вставлять фрагменты непосредственно в плазмиду с использованием совместимых рестрикционных сайтов.
- Методы, основанные на рекомбинации. Клонирование по системе «Gateway» — это метод клонирования рекомбинантной ДНК, в котором используются сайты рекомбинации и специализированные векторы для эффективного переноса фрагментов ДНК между плазмидами. Метод Гибсона (Gibson Assembly) позволяет осуществлять бесшовную сборку нескольких фрагментов ДНК с использованием перекрывающихся последовательностей, что позволяет обойтись без применения рестриктаз и лигаз.
- Сайт-направленный мутагенез. Сайт-направленный мутагенез — это метод, используемый для введения определённых мутаций в последовательность ДНК, что позволяет исследователям изучать функциональное значение нуклеотидных изменений. Для генерации мутаций могут применяться различные методы, такие как методы, основанные на удлинении праймеров, ПЦР с перекрывающимся удлинением или наборы для сайт-специфического мутагенеза, которые вводят желаемые изменения в определённых местах последовательности ДНК.
Важность дизайна плазмид в генной инженерии
Дизайн плазмид является решающим фактором успеха применения методов генной инженерии. Правильно сконструированная плазмида может повысить эффективность трансфекции, улучшить экспрессию генов и обеспечить безопасность систем доставки генов. В следующих разделах рассматривается значение дизайна плазмид в различных контекстах.
- Повышение эффективности трансфекции. Эффективность трансфекции определяется способностью плазмиды проникать в клетки и доставлять свой генетический груз. Дизайн плазмид может существенно влиять на эффективность трансфекции, причем более мелкие плазмиды, как правило, оказываются более эффективными. Удаляя ненужный генетический материал и оптимизируя состав плазмид, исследователи могут улучшить их способность к трансфекции в клетки.
- Улучшение экспрессии генов. Дизайн плазмид также влияет на уровни экспрессии генов. Выбор промотора, точки начала репликации и других элементов может повлиять на транскрипцию и трансляцию вставленного гена. Тщательно подбирая эти компоненты, исследователи могут достичь желаемого уровня экспрессии генов, адаптированного к конкретным потребностям конкретного применения.
- Обеспечение безопасности. Безопасность является первостепенной задачей в генной инженерии, особенно при терапевтическом применении. Конструкция плазмид может влиять на их профиль безопасности, причем исключение постороннего генетического материала снижает риск непреднамеренных эффектов. Оптимизируя конструкцию плазмид, исследователи могут повысить безопасность систем доставки генов.
Плазмиды с трансгенами rAAV
Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV) — это вирусный вектор, широко используемый в генной терапии и исследованиях в области молекулярной биологии. Помимо того, что rAAV не являются патогенными, они представляют большой интерес благодаря способности эффективно доставлять генетический материал (трансген) в клетки и ткани-мишени при трансдукции, при этом обладая низкой иммуногенностью.Плазмиды для трансгенов Easy rAAV включают следующие элементы конструкции :
Bgh-PA : Сигнал полиА (PA) бычьего гормона роста (Bgh) обеспечивает полиаденилирование и, таким образом, терминацию транскрипции.
eZ-Ori: Оригинал репликации представляет собой оригинал репликации с высоким числом копий (pMB1 Ori), оптимизированный компанией e-Zyvec® для оптимальной сборки и максимального выхода амплификации плазмиды в E. coli.
GOI: Геном интереса (GOI) — это кодирующая последовательность, вводимая в клетки-мишени. Как правило, емкость вектора AAV ограничена примерно 4,7 кб ДНК (включая промотор и сайт терминации), поскольку это максимальный размер, который вирус может эффективно переносить. На практике рекомендуется не превышать этот предел, чтобы обеспечить оптимальную эффективность упаковки и трансдукции.
ITR: инвертированные терминальные повторы (ITR) — это последовательности, необходимые для репликации и упаковки (рекомбинантного) вирусного генома. Они служат сайтами распознавания для вирусных ферментов, инициирующих процесс репликации ДНК и упаковки в новые вирусные частицы.
KanR: Кассета устойчивости к канамицину — это прокариотическая кассета экспрессии, которая поможет нам идентифицировать и отобрать подходящие кандидаты в векторы в процессе амплификации с помощью E. coli.
Kozak: последовательность нуклеотидов в эукариотической мРНК, которая распознается рибосомой и используется ею в качестве стартового сайта трансляции.
Плазмиды Easy LV для трансгенов
Для получения лентивирусных частиц, способных эффективно доставлять GOI в интересующие клетки, мы разработали плазмиду Easy lentiviral pTransgene третьего поколения, предназначенную для совместной трансфекции в упаковочные клетки вместе с упаковочными лентивирусными плазмидами, кодирующими вирусные компоненты Gag, Pol, Rev, VSV-G, а также с реагентами для трансфекции.
Плазмиды Easy LV transgene включают следующие элементы конструкции:5'- и 3'-лентивирусные плечи: эти две последовательности содержат важные структурные и регуляторные элементы, необходимые для транскрипции трансгена и его интеграции в геном клетки-хозяина. К этим элементам относятся область вирусного промотора ЦМВ, модифицированные последовательности длинных терминальных повторов (LTR), последовательность cPPT, последовательность Psi, последовательность RRE и сигнал PolyA.
eZ-Ori: Оригинал репликации представляет собой оригинал репликации с высоким числом копий (pMB1 Ori), оптимизированный компанией e-Zyvec для обеспечения оптимальной сборки и максимального выхода амплификации плазмиды в E. coli.
GOI: GOI (ген интереса) — это последовательность, экспрессию которой вы хотите наблюдать в целевых клетках.
KanR: Прокариотическая кассета устойчивости к канамицину состоит из промотора, гена nptII и терминатора в форме шпильки, обеспечивая устойчивость к антибиотику бактериям, экспрессирующим её.
Kozak: Последовательность нуклеотидов в эукариотической мРНК, которая распознаётся рибосомой и используется ею в качестве сайта начала трансляции.
PuroR: Ген устойчивости к пуромицину (ген Pac) представляет собой эукариотический селективный маркер в лентивирусном трансгене Sartorius Polyplus easy, который позволит вам отбирать трансдуцированные клетки. В этой простой плазмиде его экспрессия регулируется конститутивным промотором вируса обезьян 40.
WPRE : «Посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка» значительно повышает стабильность мРНК и её экспорт из ядра, тем самым увеличивая уровень экспрессии трансгенов.
