В целях дальнейшего снижения затрат и повышения эффективности все большее число фармацевтических ком-паний переходят на процесс предварительного культивирования клеточных культур поколения N-1 в сосудах N. В этой статье представлена схема процесса мелкомасштабного культивирования с использованием одноразовой технологии компании BioLink и сравниваются её преимущества с традиционным культивированием в партиях.
Применение данного процесса обеспечивает более гибкий выбор технологического решения. Одноразовый волновой биореактор CytoLinX® WB и одноразовый биореактор CytoLinX® BR серии с рабочими объемами от 50 л до 2000 л от компании BioLink могут обеспечить беспрепятственное масштабирование производства, представляя собой мощное одноразовое оборудование для оптимизации процессов.
Одноразовый волновой биореактор CytoLinX® WB
Преимущества оборудования
Особенностями применения волнового биореактора CytoLinX® WB является то, что объём культивации варьируется от 0,1 л до 100 л. Он обладает удобным и стабильным программным интерфейсом, соответствующим требованиям раздела 21 Свода федеральных нормативных актов США (CFR), ч. 11. В дополнение к этому данные биореакторы имеют модули измерения pH и растворенного кислорода, точное измерение газа с помощью регуляторов массового расхода газа (MFC). Широкий ассортимент расходных материалов, включая базовые датчики, датчики pH и растворенного кислорода, а также решения для перфузии. Доступны конфигурации прибора, подходящие для клеточной терапии.
Одноразовый биореактор CytoLinX® BR 50-2000 л
Особенности одноразового ёмкостного биореактора CytoLinX® BR является то, что объём реактора для культивирования варьируется от 50 до 2000 л., они оснащены удобным интерфейсом с принципом «подключи и работай» и возможностью применения единого модуля управления несколькими биореакторами. При этом используется стабильная распределенная система управления (DCS), соответствующая стандарту управления ISA 88. А программное обеспечение биореактора разработано в соответствии с требованиями раздела 21 Свода федеральных нормативных актов США (CFR), ч. 11. Доступны различные варианты расходных материалов и аксессуаров, включая барботер для создания крупных, средних пузырьков и микропузырьков для решения различных технологических задач.
Проведение эксперимента Проведена оценка эффективности одноразового биореактора CytoLinX® BR и одноразового волнового биореактора CytoLinX® WB при оптимизации производства антител с применением периодической загрузки. Для этого эксперимента использовали клетки CHO-K1 и CHO-DG44. Размножение клеток проводилось в одноразовом волновом биореакторе CytoLinX® WB, после чего клетки перенесли в одноразовый емкостной биореактор CytoLinX® BR объемом 200 л. При проведении обоих этапов эксперимента получены ожидаемый выход антител.
На следующем изображении показан превосходный эффект контроля параметров процесса, демонстрируемый одноразовым емкостным биореактором CytoLinX® BR при культивировании клеток.
Рисунок 1: CytoLinX® BR-200. Результаты 14-дневного культивирования клеток (кривые обозначают вес, растворенный кислород, температуру и pH)
Методика эксперимента:
Для этого эксперимента использовали клетки CHO-DG44 и CHO-K1. Клетки восстанавливали из замороженных хранилищ в соответствии со стандартными методами, а затем пересеивали и амплифицировали во встряхиваемых колбах каждые три-четыре дня. При достижении достаточного количества клеток их переносили в биореакторы CytoLinX® WB и CytoLinX® BR-200 для дальнейшего культивирования.
Эксперимент 1: размножение клеток CHO-DG44, размножение N-1 и стадия перфузионной культуры.
Параметры и условия работы
Рабочие параметры и условия для одноразового волнового биореактора CytoLinX® WB (клетки CHO-DG44)
| Мешок для клеточных культур | CytoLinX® для клеточных культур на 20 л |
| Угол и скорость | 20 об/мин, 6–8° |
| Расход газа | 0,2 л/мин 95% воздуха + 5% CO₂ |
| Значение pH | Без контроля pH (начальная концентрация углекислого газа в свободном объёме над продуктом составляет 5%) |
| Рабочий объем | 10 л |
Рабочие параметры и условия для биореактора CytoLinX® BR-200 на стадии размножения N-1 (клетки CHO.DG44)
| Мешок для клеточных культур | Мешок для клеточных культур CytoLinX® BR на 200 л |
| Угол и скорость | 70 об/мин |
| Подача воздуха из барботера | 2 л/мин, большие пузырьки 0,8 мм |
| Подача O2 и CO2 из барботера | Согласно стратегии объединения, средние пузырьки размером 180 мкм |
| Растворенный кислород | 40% |
|
Стадия размножения N-1 Рабочий объем |
40 л |
Рабочие параметры и условия для биореактора CytoLinX® BR-200 на стадии периодической загрузки (клетки CHO-DG44)
| Мешок для клеточных культур | Мешок для клеточных культур CytoLinX® BR на 200 л |
| Угол и скорость | 110 об/мин |
| Этап подачи | CO2 используется для контроля значения pH 7,0±0,2 |
| Подача воздуха из донного барботера | 2 л/мин, большие пузырьки 0,8 мм |
| Подача O2 и CO2 из донного барботера | Согласно стратегии объединения, средние пузырьки размером 180 мкм |
| Растворенный кислород | 40% |
|
Этап подачи Рабочий объем |
Начальный объем культуры составляет 140 л, собрано 175 л. |
| Стандартные условия сбора | >13 суток или жизнеспособность клеток < 80% |
Результаты эксперимента 1: Кривая роста клеток и биохимические данные представлены на рисунке 2 и рисунке 3, соответственно.
Рисунок 2: График плотности роста и кривой жизнеспособности клеток CHO DG44
Рисунок 3: Биохимические данные клеток CHO-DG44: график кривой лактата и pCO2
Рабочие параметры и условия для одноразового волнового биореактора CytoLinX® WB (клетки CHO-K1)
| Мешок для клеточных культур | Мешок для клеточных культур CytoLinX® WB на 20 л |
| Угол и скорость | 20 об/мин, 6–8° |
| Расход газа в волновом биореакторе | 0,3 л/мин |
| Значение pH |
Без контроля pH (начальная концентрация углекислого газа в свободном объеме над продуктом составляет 5%) |
| Рабочий объем | 10 л |
Эксперимент 2: Рабочие параметры и условия для размножения клеток CHO-K1, стадии размножения N-1 и стадии культивирования с периодической загрузкой.
Стадия роста N-1, рабочие параметры и условия для биореактора CytoLinX® BR-200 (клетки CHO-K1)
| Мешок для клеточных культур | Мешок для клеточных культур CytoLinX® BR на 200 л |
| Угол и скорость | 70 об/мин |
| Подача воздуха из донного барботера | 2 л/мин, большие пузырьки 0,8 мм |
| Подача O2 и CO2 из донного барботера | Согласно стратегии объединения, большие пузырьки размером 0,8 мм |
| Растворенный кислород | 40% |
|
Рабочий объем на стадии размножения N-1 |
40 л |
Стадия периодической загрузки, рабочие параметры и условия для биореактора CytoLinX® BR-200 (клетки CHO-K1)
| Мешок для клеточных культур | Мешок для клеточных культур CytoLinX® BR на 200 л |
| Угол и скорость | 110 об/мин |
| Этап подачи | CO2 используется для контроля значения pH в диапазоне 7±0,2 |
| Подача воздуха из донного барботера | 2 л/мин, большие пузырьки 0,8 мм |
| Подача O2 и CO2 из донного барботера | Согласно стратегии объединения, большие пузырьки размером 0,8 мм |
| Растворенный кислород | 40% |
| Рабочий объем на стадии и периодической загрузки | Начальный объем культуры составляет 140 л, собрано прибл. 175 л. |
| Стандартные условия сбора | >13 суток или жизнеспособность клеток < 80% |
Рисунок4: График плотности роста и кривой жизнеспособности клеток CHO-K1
pCO2 CHO-K1 (мм рт. ст.)
Молочная кислота CHO-K1 (г/л)
Рост клеток CHO-K1, плотность инокуляции посевного материала на стадии роста N-1 и стадии периодической загрузки культуры
| ШАГ 3: Волновой биореактор CytoLinX® WB, N-2 | 0,5±0,2 * 106 жизнеспособных клеток/мл |
| Шаг 4: Одноразовый биореактор CytoLinX® BR-200 N-1 | 0,5±0,2 * 106 жизнеспособных клеток/мл |
|
Шаг 5: Одноразовый биореактор CytoLinX® BR-200 Периодическое культивирование с подпиткой |
1±0,2 * 106 жизнеспособных клеток/мл |
Результат эксперимента 2: Кривая роста клеток и биохимические данные клеточной культуры представлены на рисунке 4 и рисунке 5.
Рисунок 5: Биохимические данные клеток CHO-K1: график кривой лактата и pCO2
Начальный объем культуры CytoLinX® BR-200 составляет 140 л. При ежедневном добавлении конечный объем CytoLinX® BR-200 на момент сбора клеток составляет примерно 175 л. Как показано на рис. 2 и рис. 4, клетки, культивируемые в двух разных биореакторах, демонстрируют очень похожие кривые роста с тремя различными фазами роста: начальная фаза быстрого роста в течение первых 72 часов, затем фаза более медленного роста, а затем фаза плато, где жизнеспособность клеток постепенно снижается до момента сбора клеток. Клетки собирают, когда их жизнеспособность составляет от 93,62% до 93,1%. Обе культуры достигли ожидаемых результатов.
Как показано на рис. 3 и 5, во время обоих экспериментов наблюдается схожая тенденция к росту pCO2. Кривая парциального давления углекислого газа (pCO2) при культивировании показана на рисунке. На ранних стадиях культивирования клетки вырабатывают лактат для снижения pCO2 и поддержания pH. И наоборот, pCO2 будет увеличиваться по мере снижения концентрации лактата и увеличения концентрации солей и оснований в ходе подпитки.
Резюме
Результаты демонстрируют, что одноразовый емкостной биореактор CytoLinX® BR 50–2000 пригоден для использования как для выращивания посевного материала, так и для крупномасштабного производства. Две партии клеточных культур продемонстрировали схожую плотность клеток, жизнеспособность, концентрацию метаболитов и выход антител в обоих биореакторах. Во время двух последовательных экспериментов биореактор CytoLinX® BR продемонстрировал стабильный контроль процесса и эффективную экспрессию белка, оправдав производственные ожидания клиентов. Биореакторы серии CytoLinX® BR демонстрируют отличную стабильность при управлении параметрами процесса выращивания культуры клеток, обеспечивая надежное и эффективное решение для амплификации и производства рекомбинантных белков и антител.