Комплексные решения для экзосом

Экзосомы активно секретируются большинством живых клеток в процессе экзоцитоза и содержатся в таких жидкостях организма, как плазма, моча, сыворотка, слюна и спинномозговая жидкость (СМЖ).

Имея структуру липидного бислоя, экзосомы несут в себе характерные трансмембранные белки и рецепторы, молекулы адгезии, белки, связанные с липидным плотом, и иммуномодулирующие молекулы. В просвете экзосом можно обнаружить различные белки и нуклеиновые кислоты, варьирующие в зависимости от типа клеток.

Являясь ключевыми медиаторами межклеточной коммуникации, экзосомы доставляют биологически активные молекулы в клетки-реципиенты, тем самым участвуя в широком спектре патофизиологических процессов, включая опухолевый генез, сердечно-сосудистые заболевания и нейродегенеративные расстройства.

В последние годы благодаря развитию технологий и экспериментальным открытиям было доказано, что экзосомы могут применяться для ранней диагностики рака, прогнозирования и терапевтического сопровождения. Кроме того, благодаря своим природным свойствам наночастиц и структурной стабильности, экзосомы обладают потенциалом носителей для разработки систем адресной доставки лекарств.

Для применения экзосом необходимо отличать их от других популяций внеклеточных везикул, таких как микровезикулы (которые отпочковываются от плазматической мембраны и также называются эктосомами или отделяющимися везикулами) и апоптотические тельца. С развитием технического прогресса было разработано множество методов выделения экзосом, каждый из которых имеет свои преимущества и ограничения.

Распространенные методы выделения экзосом

• Иммуноаффинное разделение:

• Ультрацентрифугирование:

• Полимерная преципитация: 

В этом методе полимеры (например, ПЭГ) конкурентно связываются со свободными молекулами воды, в результате чего экзосомы выпадают в осадок, который затем извлекается центрифугированием. К преимуществам метода относятся минимальное повреждение экзосом, использование нейтрального рН, простота работы и высокая степень извлечения. Недостатками являются более низкая чистота, более высокий уровень примесей, невозможность масштабирования процесса центрифугирования, более высокая стоимость и более длительное время обработки.

• Ультрафильтрация: 

Этот метод использует ультрафильтрацию для разделения экзосом. Преимуществом является простота и скорость процесса. Основными недостатками являются низкий процент извлечения, поскольку экзосомы могут прилипать к ультрафильтрационной мембране, что приводит к снижению выхода. Кроме того, экзосомы чувствительны к силе сдвига, и нестабильный контроль давления и силы сдвига может привести к деформации экзосом, что нарушит их целостность.

• Хроматография:

Этот метод разделяет экзосомы по размеру частиц с помощью специальных сорбентов. Преимуществами являются высокая чистота, высокий выход, масштабируемость и воспроизводимость процесса. Все чаще исследователи отдают предпочтение хроматографии с использованием сорбентов для разделения и очистки экзосом, получая образцы высокой чистоты.

Компания BioLink предлагает комплексные решения для очистки экзосом. Для работы с культурой клеток на этапе upstream в мелкосерийном производстве может использоваться одноразовый волновой биореактор CytoLinX® WB, а в крупносерийном производстве - одноразовый осевой биореактор CytoLinX® BR. Эти варианты подходят для различных масштабов производства, обеспечивая гибкость и эффективность.

Одноразовый волновой биореактор CytoLinX® WB 

CytoLinX® WB Single-use Rocking Bioreactor

• Удобный интерфейс, стабильный и надежный контроль, что гарантирует соответствие требованиям 21 CFR Part 11.
• Дополнительные модули включают в себя системы pH, DO и перфузии, что позволяет настроить прибор в соответствии с конкретными потребностями.
• Поток газа точно измеряется с помощью контроллера массового расхода (MFC), обеспечивая точное и надежное регулирование.
• Расходные материалы доступны в различных вариантах исполнения, включая базовые модели, модели, оснащенные электродами pH и DO, и перфузионные модели.
• Одноразовые расходные материалы предназначены для систем клеточной терапии.

CytoLinX® BR Single-use Bioreactor

Гибкость и надежность технических решений:

• Гибкость системы управления PCS 7 соответствует спецификациям системы пакетного управления ISA 88, что позволяет реализовать функции пакетного управления.
• Позволяет управлять партиями в масштабах всего предприятия, поддерживает быструю замену контроллеров и может подключаться к нескольким реакторам. 
• Стабильность управления оборудованием является исключительной, с отличным взаимодействием между температурой, pH и DO.

Безопасность и разнообразие расходных материалов:

• Широкий выбор расходных материалов, включая микро-, средне- и макроспарджеры, позволяет удовлетворить различные технологические потребности.
• Импортные газовые фильтры обеспечивают целостность мешков.

Решения по Downstream очистке  могут быть адаптированы к различным процессам в зависимости от технологических требований. Мультимодальные смолы BioLink демонстрируют лучшую производительность при работе с экзосомами.

Мультимодальная смола BioLink серии MaXtar® COLL имеет двухслойную структуру. Ее оболочка состоит из пористого пассивирующего слоя, а сердцевина представляет собой сферическую внутреннюю часть, функционализированную лигандами, проявляющими как гидрофобное взаимодействие, так и анионные адсорбционные свойства. Такая конструкция оптимизирует удаление примесей, таких как белки и нуклеиновые кислоты хозяина. Серия MaXtar® COLL включает в себя:

• MaXtar® COLL 400 (гарантирует, что молекулы размером более 400 кДа не попадут в поры и пройдут непосредственно через внешний поток воды),

•  MaXtar® COLL 700 (гарантирует, что молекулы размером более 700 кДа не попадут в поры и пройдут непосредственно через внешний поток воды).

MaXtar® COLL dual-layer structure

По сравнению с традиционными одномодальными хроматографическими сорбентами серия MaXtar® COLL демонстрирует превосходные характеристики:

• Уникальная двухслойная структура позволяет проводить сквозную обработку макромолекул, упрощая оптимизацию процесса и обеспечивая возможность линейного масштабирования.
• Улучшенная матрица MaXtar® обладает повышенной жесткостью, что позволяет увеличить скорость потока при более низком противодавлении, повышая тем самым эффективность процесса.
• По сравнению с традиционной гель-фильтрационной хроматографией, серия MaXtar® COLL обеспечивает значительно большую загрузку образцов, что приводит к снижению затрат.

Мультимодальные сорбенты MaXtar® COLL от компании BioLink демонстрируют отличные показатели при разделении экзосом. На основании анализа образцов, полученных в ходе тестирования, проведенного заказчиком, было подтверждено, что цели разделения в рамках данного проекта могут быть достигнуты. В настоящее время ведется дальнейшая оптимизация условий.

COLL700, flow-through mode (blue), COLL400, flow-through mode (orange)

Кроме того, половолоконные модули все чаще используются как для предварительной очистки, так и для последующего разделения и очистки. Различные размеры пор полых волокон выбираются в зависимости от желаемого конечного результата для достижения более высокой чистоты продуктов. Фильтры из полых волокон TFFNOVA®, поставляемые компанией BioLink, широко используются в вакцинной промышленности, а в индустрии экзосом полые волокна также могут применяться для очистки или сбора в зависимости от конечной цели.

Фильтры из полых волокон TFFNOVA®, поставляемые компанией BioLink, разрабатываются и производятся в соответствии с системой управления качеством ISO 9001:2015. Каждый фильтр проходит строгий контроль качества и поставляется с сертификатом качества.

Биосовместимость: Все материалы проточной части соответствуют стандарту биосовместимости USP <88> Class VI;
Пределы содержания микроорганизмов: < 1000 КОЕ/единицу;
Эндотоксины: < 0,25 EU/мл;
Отсутствие материалов животного происхождения: Сырье, используемое в фильтрах, не содержит ингредиентов или производных животного происхождения.
Валидация транспортировки и упаковки: Соответствует требованиям ISTA 3A (2008).

Экзосомы, как новый класс терапевтических препаратов, также применяются в клинических исследованиях. Если небольшие образцы для исследований можно получать различными методами, то для производства коммерческих или клинических образцов фаз II и III потребуются стабильные процессы и соответствующие нормативным требованиям рабочие процессы. Различные методы очистки будут все чаще применяться в промышленности.