По данным профильных исследований, от 5 до 30 % клеточных культур заражены микоплазмой. Частота вирусной контаминации распространённых клеточных линий может превышать 25 %. При этом нецитопатические вирусы и микоплазмы часто остаются незамеченными, так как не вызывают выраженных визуальных изменений культуры.
Обнаружение загрязнений
Контроль контаминации во многом зависит от возможности её выявления. Бактериальные, грибковые и дрожжевые загрязнители обычно быстро обнаруживаются визуально — по помутнению среды и изменению её цвета, а также при стандартной световой микроскопии. В то же время микоплазмы сложно идентифицировать из-за их малого размера и отсутствия характерной морфологии, а вирусы вовсе не видны в световой микроскоп и выявляются лишь по косвенным признакам ухудшения состояния клеток.
Микробное загрязнение: причины и профилактика
Наиболее частыми источниками микробной контаминации являются ошибки при работе оператора, нестерильные материалы, загрязнённые реагенты и оборудование, а также пыль и аэрозоли в помещении. Для раннего выявления рекомендуется ежедневный микроскопический контроль культур и регулярное тестирование на бактерии и грибки.
Ключевые профилактические меры включают:
- строгую асептику при манипуляциях и дозировании;
- регулярную дезинфекцию рабочих поверхностей 70 % спиртом;
- использование стерильных одноразовых расходных материалов;
- правильное хранение и обработку бутылок, колб и инструментов;
- регулярную очистку инкубаторов, шкафов биологической безопасности и вспомогательного оборудования.
Загрязнённые культуры необходимо немедленно утилизировать, чтобы предотвратить распространение контаминантов на соседние образцы и оборудование.
Микоплазма: скрытая угроза
Микоплазмы — бактерии без клеточной стенки, нечувствительные к ряду антибиотиков и способные проходить через стандартные фильтры с порами 0,22 мкм. Они не вызывают помутнения среды и редко приводят к гибели клеток, однако существенно влияют на их метаболизм, рост, адгезию и генетическую стабильность, что может искажать результаты экспериментов.
Источниками микоплазмы могут быть кожа человека, заражённые сыворотки и добавки, а также перекрёстное заражение между культурами. Для выявления микоплазмы применяют культивирование, окрашивание ДНК (DAPI, Hoechst) и ПЦР. Регулярное тестирование является обязательным элементом контроля качества.
Вирусная контаминация
Вирусы относятся к наиболее трудновыявляемым загрязнителям клеточных культур. Они могут поступать из первичных тканей, заражённых клеточных линий или компонентов животного происхождения. Из-за малого размера вирусы практически невозможно удалить из сывороток и сред.
Хотя многие вирусы обладают видовой и тканевой специфичностью и не всегда вызывают выраженный цитопатический эффект, они могут представлять риск как для экспериментов, так и для здоровья персонала. При работе с клетками человека и приматов требуется соблюдение усиленных мер биобезопасности.
Для снижения риска вирусного заражения рекомендуется:
- ограничивать количество биологических источников;
- использовать клетки из проверенных хранилищ;
- выбирать поставщиков, предоставляющих подтверждение вирусной безопасности.
Химическое загрязнение
К химическим контаминантам относят неживые примеси, включая ионы металлов, остатки моющих средств, дезинфектанты, свободные радикалы и эндотоксины. Они могут присутствовать в воде, реагентах, расходных материалах и оборудовании и оказывать токсическое воздействие на клетки даже при отсутствии микробного загрязнения.
Для профилактики следует использовать воду лабораторного качества, тщательно промывать многоразовую посуду и приобретать среды, добавки и сыворотки только у поставщиков с контролем уровня эндотоксинов.
Общие принципы профилактики
Эффективная работа в шкафу биологической безопасности требует правильной циркуляции воздуха, предварительной подготовки материалов и обработки всех предметов спиртом перед началом работы. Минимизация аэрозолей при дозировании, использование индивидуальных дозаторов и регулярная дезинфекция оборудования снижают риск контаминации.
При выборе дезинфицирующих средств необходимо учитывать их эффективность, совместимость с поверхностями и безопасность для персонала. Наиболее широко применяются спирты и хлорсодержащие соединения, тогда как фенольные средства использовать не рекомендуется.
Распространенные причины и методы предотвращение микробного загрязнения
|
Причина, источник |
Как избежать |
|
Техника: |
|
|
Манипуляции и дозирование |
|
|
Нестерильные поверхности и оборудование |
Очистите рабочую зону от предметов, которые не используются в данный момент. |
|
Проливание материала на горлышко и стенки бутылок, а также на рабочую поверхность |
Регулярно протирайте поверхности 70% спиртом. Не выливайте жидкости. Дозируйте с помощью дозатора, автодозатора или переносного устройства. Если выливание жидкости неизбежно: делайте это одним плавным движением, выбрасывайте бутылку, из которой выливали жидкость. |
|
Прикосновение к наконечнику или удержание дозатора слишком близко к наконечнику, прикосновение к горлышкам бутылок, внутренней части винтовых крышек |
Держите дозаторами дальше от наконечника. |
|
Брызги из стакана для отходов |
Выбрасывайте отходы в стакан с воронкой или, по возможности, используйте вакуум для удаления отходов. |
|
Осадочная пыль на культуре или бутылке пыль или частицы кожи; руки или приборы, расположенные над открытой чашкой, бутылкой |
Никогда не работайте над открытыми сосудами .Не работайте над (вертикальный ламинарный поток и открытый стол) или за и над (горизонтальный ламинарный поток) открытой бутылкой или чашей. |
|
Волосы, руки, дыхание, одежда оператора |
|
|
Пыль с кожи, волос или одежды, попавшая в культуру |
Тщательно мойте руки, носите лабораторный халат без ворса. Используйте лабораторный халат, предназначенный исключительно для помещения для культивирования. Завязывайте длинные волосы или надевайте шапочку. При необходимости разговаривать, поворачивайтесь спиной к рабочему месту. |
|
Аэрозоли, образующиеся при разговоре, кашле, чихании и т. д. |
Избегайте работы с простудой или надевайте маску. |
|
Материалы и реагенты |
|
|
Растворы |
|
|
Нестерильные растворы и среды |
Перед использованием фильтруйте или автоклавируйте растворы. |
|
Ненадлежащие процедуры стерилизации |
Контролируйте работу автоклава с помощью регистрирующего термометра или индикатора стерильности. При подозрении на загрязнение тестируйте или культивируйте стерилизованные растворы. |
|
Плохой контроль качеств ан стороне поставщика |
Покупайте среды, буферы и сыворотки только у надежных поставщиков, которые подтверждают качество и происхождение продукции. |
|
Стеклянная тара и винтовые крышки |
|
|
Пыль и споры от хранения |
Накройте колбы фольгой. Протрите бутылки 70% спиртом, прежде чем помещать их в вытяжной шкаф. |
|
Инструменты, дозаторы |
|
|
Ненадежная стерильность |
Используйте индивидуально упакованные стерильные одноразовые материалы от надежных поставщиков. Перед использованием стерилизуйте многоразовые предметы сухим теплом. |
|
Контакт с нестерильной поверхностью или другим материалом |
Не прикасайтесь к частям инструментов или дозаторов, которые будут погружаться в культуральный сосуд. |
|
Используемые культуральные колбы и бутылки для сред |
|
|
Пыль и споры из инкубатора или холодильника |
Используйте винтовые крышки вместо пробок. Протирайте бутылки перед помещением в вытяжной шкаф. Используйте вторичную емкость для чашек. |
|
Нечистые условия хранения или инкубации |
Накрывайте крышки и горлышки бутылок алюминиевой фольгой во время хранения или инкубации. Регулярно очищайте хранилища и инкубаторы. |
|
Среда под крышкой и распространяющаяся на внешнюю поверхность бутылки |
Утилизируйте все бутылки, на горлышках которых видны следы разлива. Не переливайте жидкость. |
|
Оборудование и помещения |
|
|
Воздух в помещении |
|
|
Сквозняки, вихри, турбулентность, пыль, аэрозоли |
Выделите подходящее место для культивирования тканей/клеток. Сократите движение и постороннюю деятельность. Регулярно протирайте пол и рабочие поверхности. |
|
Шкафы биологической безопасности |
|
|
Перфорированный фильтр |
Регулярно проверяйте фильтры на наличие отверстий и утечек. |
|
Загрязнение фильтра |
Проверяйте падение давления на фильтре. |
|
Разливы, особенно в щелях или под рабочей поверхностью |
Регулярно дезинфицируйте пространство вокруг и под рабочей поверхностью. |
|
Инкубаторы с увлажнением CO2 |
|
|
Рост плесени и бактерий на стенах и полках во влажной атмосфере |
Регулярно очищайте в соответствии с инструкциями производителя с помощью соответствующих дезинфицирующих средств. |
|
Споры и т. п., переносимые при принудительной циркуляции воздуха |
Закрывайте открытую посуду пластиковыми крышками (но не запечатывайте крышки). |
|
Ванны и другое оборудование |
|
|
Загрязнение в водяных банях, используемых для нагрева растворов |
Регулярно очищайте и дезинфицируйте водяную баню; тщательно протирайте посуду 70% спиртом перед переносом в шкаф биологической безопасности для использования после высыхания. |
|
Пыль на газовых баллонах, насосах и т. д. |
Рассмотрите возможность использования неводной (бисерной) нагревательной бани. Перед входом в помещение для культивирования протрите 70% спиртом. |
|
Используемые биологические материалов |
|
|
Поступающие клеточные линии |
|
|
Подозрение на загрязнение в месте происхождения или во время транспортировки |
Обращайтесь с этими клеточными линиями изолированно, предпочтительно в карантине. Проверьте на наличие загрязнения, выращивая культуру в течение двух недель без антибиотиков. Проверьте на наличие загрязнения визуально, с помощью фазово-контрастной микроскопии и окрашивания Hoechst/DAPI на микоплазму. |
