Анализ ключевых аспектов культивирования рекомбинантной Escherichia coli с высокой плотностью

В процессе промышленного производства культивирование модифицированных бактерий с высокой плотностью напрямую влияет на экспрессию и стоимость производства целевого продукта. В этой статье мы рассмотрим несколько ключевых факторов, влияющих на культивирование кишечной палочки с высокой плотностью, и кратко опишем их.

Оптимизация питательной среды

1 Выбор источников углерода и контроль за параметрами

При использовании глюкозы в качестве источника углерода скорость роста кишечной палочки повышается, а метод определения концентрации сахара прост. Таким образом, глюкоза является наиболее часто используемым источником углерода при культивировании кишечной палочки. Стоит отметить, что когда глюкоза используется в качестве источника углерода при культивировании с высокой плотностью, ее концентрацию необходимо строго контролировать. Если концентрация остаточного сахара в питательной среде слишком высока, в процессе метаболизма сахара будет вырабатываться большое количество уксусной кислоты, что повлияет на рост бактерий и выход продукта. Глицерин, напротив, не так способствует метаболизму, как глюкоза, и вырабатывает меньше кислоты, может способствовать более мягкому началу брожения и является эффективной стратегией для снижения накопления уксусной кислоты.

2 Источник азота и соотношение углерода и азота

Источник азота включает в себя комплексный источник азота и неорганический источник азота. Сложные источники азота (дрожжевой экстракт (ДЭ), пептон) богаты аминокислотами, витаминами, микроэлементами и факторами роста, которые могут значительно ускорить рост бактерий и повысить конечную плотность. Однако они стоят дорого, а их состав до конца не изучен, что может усложнить последующую очистку. Неорганический источник азота (сульфат аммония) имеет понятный состав, низкую стоимость и прост в последующей обработке. Однако из-за отсутствия факторов роста скорость роста и конечная плотность бактерий могут быть ограничены. Поэтому в процессе ферментации часто используются смешанные источники азота, которые не только обеспечивают факторы роста, но и снижают затраты, а также предоставляют достаточное количество источников азота, что даёт двойное преимущество.

3 Неорганические соли и микроэлементы

В питательной среде  неорганические соли служат каркасом для построения клеток и поддержания основных физиологических функций, а микроэлементы играют ключевую роль в тонкой регуляции метаболизма, особенно синтеза целевых продуктов. Их потребность сильно варьируется, но все они подчиняются принципу «умеренность полезна, избыток токсичен». При разработке и оптимизации процесса культивирования одним из ключевых этапов, позволяющих повысить плотность бактерий и выход продукта, является эффективный контроль типов и концентраций неорганических солей и микроэлементов.

Метод культивирования

В процессе культивирования, чтобы повысить плотность E. coli, часто бывает необходимо добавить в реактор концентрированную свежую питательную среду, чтобы пополнить питательные вещества, необходимые для роста бактерий.

1 Подача без обратной связи

Подача с постоянной скоростью - это простая, практичная, но неоптимальная стратегия выращивания культур с высокой плотностью. Его суть заключается в ограничении скорости роста микроорганизмов за счёт фиксированной скорости подачи питательных веществ, что позволяет решить три основные проблемы при культивировании с высокой плотностью: ингибирование субстрата, образование побочных продуктов и недостаточное снабжение кислородом. Этот метод в основном применяется в традиционном процессе ферментации при производстве рекомбинантных белков, который не требует тщательной оптимизации технологии производства. Несмотря на то, что это не оптимальное решение, простота и надёжность этого метода делают его по-прежнему широко используемым в лабораторном и промышленном производстве.

Экспоненциальное периодическое культивирование с подпиткой

Это перспективная стратегия ферментации, основанная на надёжной теоретической модели. Она позволяет точно контролировать клеточный метаболизм за счёт синхронизации скорости подачи субстрата с экспоненциальной тенденцией роста микроорганизмов . Несмотря на то, что этот метод требует более сложного оборудования и технологий, его огромные преимущества в плане повышения выхода, качества и воспроизводимости процесса делают его ключевой технологией в области современного биопроизводства. В основном она используется в производстве с высоким спросом, научных исследованиях, оптимизации процессов и других областях.

2 Подпитка с обратной связью

Система подпитки с обратной связью представляет собой типичную систему управления с обратной связью, которая состоит из трёх основных частей:

• Мониторинг ключевых параметров в ферментационном бульоне в режиме реального времени (например, растворённого кислорода, pH, отходящих газов и т. д.).
• Получение сигнала от датчика и его сравнение с заданным значением. Рассчет действия, которое необходимо предпринять с помощью определенного алгоритма управления (например, ПИД-регулирования), в соответствии с отклонением от заданного значения.
• Получите инструкции от контроллера и выполните их (обычно для этого нужно отрегулировать скорость подающего насоса). Этот цикл выполняется непрерывно, что позволяет автоматически оптимизировать и стабилизировать процесс.

DO-Stat/pH-Stat

DO-Stat/pH-Stat обычно используется в лабораторных масштабах, при экспрессии, индуцируемой субстратом, или в некоторых специальных процессах ферментации.

Управление на основе RQ

Управление на основе RQ — одна из самых передовых и надёжных стратегий управления в современном промышленном производстве дрожжей, культур кишечной палочки и культур клеток животных, которая позволяет добиться реальной оптимизации и масштабирования.

3 Вывод

В целом периодическая подпитка определяет «теоретически» оптимальный путь, а подпитка с обратной связью похоже на круиз-контроль и навигационную систему автомобиля, которые постоянно отслеживают реальные дорожные условия (сигналы датчиков) и автоматически регулируют дроссельную заслонку (подающий насос), чтобы транспортное средство всегда двигалось по оптимальному маршруту и могло спокойно справляться с непредвиденными ситуациями, такими как подъём в гору или встречный ветер. На практике эти два метода часто комбинируются, то есть периодическая подпитка используется в качестве основной стратегии, а сигналы обратной связи (например, RQ) используются для их точной настройки.

Заключение

Результаты показали, что в качестве источника углерода использовался глицерин, в качестве индуктора — 0,5 мМ ИПТГ, а режим культивирования сочетался с подачей питательных веществ по принципу обратной связи при условии индукции охлаждением в середине логарифмического периода. В конце ферментации оптическая плотность при 600 нм достигла 89, а уровень экспрессии продукта составил около 3 г/л.


Настольные стеклянные биореакторы CytoLinX® GB объемом 1 л, 3 л, 7 л, 15 л и 20 л имеют новую конструкцию и отличаются высокой гибкостью, что позволяет использовать электроды, трубки, газораспределители и крыльчатки существующих марок. Биореактор состоит из стеклянного сосуда и системы управления. Он широко используется при разработке процессов получения биологических продуктов. Он подходит для исследования условий и оптимизации процесса культивирования. Он подходит для культивирования различных клеток и микробной ферментации, в том числе суспензионных клеток, прикреплённых клеток, растительных клеток, клеток насекомых, ферментации E. coli и дрожжей. Кроме того, реакторы этой серии оснащены такими функциями, как программируемое автоматическое дозирование, точный контроль температуры и pH, которые успешно помогают в конъюгации ADC-препаратов и оптимизации различных типов ферментативных каталитических процессов. Автоматическое программирование позволяет избежать ошибок, связанных с ручным управлением, и обеспечивает согласованность между партиями.